الملخص

يهدف البحث إلى المقارنة بين أزهار و أوراق نبات ذهب الشمس Helichrysum italicum المزروع في دمشق من حيث محتواها من الفنولات الكلية و الفلافونوئيدات و التأثير الكاسح للجذور الحرة للخلاصات الميتانولية. أبدت الخلاصة الميتانولية للأزهار والأوراق محتوىً فنولياً متقارباً، حيث بلغ المحتوى الفنولي للأوراق: 55.2424 ملغ مكافىء حمض الغاليك/غ خلاصة جافة، الأزهار: 75.3939 ملغ مكافىء حمض الغاليك/غ خلاصة جافة، المحتوى الفلافونوئيدي للأوراق 6.6174 ملغ مكافىء كيرستين/غ خلاصة جافة و المحتوى الفلافونوئيدي للأزهار11.570ملغ مكافىء كيرستين/غ خلاصة جافة. قُيم التأثير المضاد للأكسدة بقياس التركيز الكاسحة لنصف الجذور الحرة باستخدام2,2- دي فنيل1, بيكريل هيدرازيل. أظهرت كل من خلاصة الأوراق والأزهار قدرة الكاسحة للجذور الحرة حيث بلغت 4.8633 ملغ/مل و 1.397738 ملغ/مل على التوالي.

---

كلمات مفتاحية : ذهب الشمس، محتوى الفينولات الكلي، محتوى الفلافونوئيدي الكلي، القدرة الكاسحة للجذور الحرة.

---

المقدمة Introduction:

تزايدت في الآونة الأخيرة معدلات التعرض لجذور الحرة free radical، وترافق هذا التزايد مع ظهور الأمراض المزمنة وانتشارها كالأمراض القلبيةcardiac diseases. تشكل المركبات الفينولية أهم مصادر مضادات الأكسدة الطبيعيةnatural antioxidants، فتعمل على كبح الجذور الحرة وتحول دون تراكمها وتعيق سلسلة طويلة من التفاعلات والاضطرابات الناتجة عن الجذور الحرة ومن أهمها السرطانات cancers [1]. يعرف مضاد الأكسدة أنه المركب القادر على تأخير أو تثبيط أو منع الأكسدة للمركبات القابلة للأكسدة، عن طريق كبح الجذور الحرة وتقليل الشدة التأكسدية[1]. يُحمى النظام الحيوي من الجذور الحرة بواسطة الأنزيمات dismutase وperoxidase glutathione ،وبمضادات الأكسدة الطبيعية كحمض الأسكوربيك والتوكوفيرول والكاروتينات وعديدات الفينول]1[. عندما تتعرض الخلايا لمحمول عال وغير طبيعي من المؤكسدات والجذور الحرة (الشدة التأكسديةstress oxidative)  تغدو هذه الآليات الدفاعية الطبيعية غير كافية وتقوم الجذور الحرة بمهاجمة الدسم والبروتينات والدناDNA ، وإتلاف جدران الخلايا والأنزيمات والمواد الوراثية، ينتج عنها تطور أمراض مزمنة تنكسية ومنها الأمراض القلبية الوعائية والسرطان وهشاشة العظام والأمراض العصبية المتعلقة بالشيخوخة[2]. تتضمن آليات الفينول في تثبيط الأكسدة عدة طرائق وهي كبح الجذور الحرة ROS reactive oxygen species،RNS reactive nitrogen ، وكبح تشكل ROS وRNS عن طريق تثبيط بعض الأنزيمات ومخلبة المعادن التي تتدخل في إنتاج الجذور الحرة كالحديد والنحاس، وإعادة تنظيم ووقاية الآليات الطبيعية المضادة للأكسدة [3] . تعدّ الفينول مجموعة من المركبات الكيميائية المتنوعة والمعقدة التي يقوم النبات باصطناعها. كما تنتشر في مجال واسع من النباتات الطبية. تتضمن المركبات الفلافونوئيدات flavonoids، الكاتشينات catechins، التانينات tannins، مشتقات حمض العفص gallic acid ، مشتقات حمض الكلوروجينك chlorogenic acid  ومشتقات الريزفيراتولresvetrol  [4]. ينتمي نبات ذهب الشمس Helichrysum italicum (Roth) G. Don  إلى الفصيلة النجمية Asteraceae .، و هو جنبة عطرية معمرة دائمة الخضرة يتميز بأوراقه الرفيعة الخيطية ذات لون فضي، و بأزهار ذات لون أصفر ذهبي الشكل (1). يزهر في الفترة ما بين شهري تموز و آب. يدعى أيضاً بالخالدية أو الكاري نظراً لرائحته العطرية التي تشبه رائحة نبات الكاري لكن لا صلة بين النباتين[5].

يضم جنس Helichrysum 600 نوعاً تنتشر في أنحاء العالم. إلا أن نوع Helichrysum italicum   ينمو في حوض البحر المتوسط ويفضل التربة الفقيرة الرملية الجافة على ارتفاع 2200 م. كما يستخدم كنبات زينة خاصة في الحدائق الصخرية، حيث يعتبر من النباتات المتحملة للجفاف[6]. تستخدم أزهار نبات ذهب الشمس في الطب الشعبي بوصفه مفرغاً للصفراء choleretic  ، مدرّ  diuretic  و مقشع expectorant [7]، كما يستخدم على نطاق واسع في صناعة العطور ومستحضرات التجميل[8]. أثبتت الدراسات الحديثة تأثيرات فيزيولوجية عديدة للنبات منها تأثير مضاد للالتهاب anti-inflammatory، مضاد أكسدة antioxidant، مضاد جرثومي antimicrobial ومضاد فيروسي antiviral.[9]. اهتمت أغلب الدراسات السابقة بدراسة الزيت العطري لأزهارالنبات أو الأجزاء الهوائية بالكامل، لكن لم تهتم بدراسة المحتوى الفينولي والفلافونوئيدي للأوراق علماً أن فترة إزهار النبات قصيرة الممتدة ما بين شهري تموز و آب وهو من النباتات دائمة الخضرة ويمكن الحصول على الأوراق على مدار العام . يهدف البحث إلى مقارنة المحتوى الإجمالي من الفينولات و الفلافونوئيدات والقدرة المضادة للأكسدة للخلاصة الميتانولية للأوراق ومقارنتها بأزهار نبات ذهب الشمس المزروع في دمشق.

 المواد والطرائق Materials and methods:

المادة النباتية Plant material:

جُمعت أزهار وأوراق نبات ذهب الشمس المزروع في بساتين المزة في تموز 2019. جرى التعرف على النبات وتصنيفه من قبل الدكتور عماد القاضي من كلية العلوم- جامعة دمشق (رحمه الله).  جففت النباتات بالظل بدرجة حرارة الغرفة 25 م˚ لمدة اسبوع للحصول على الوزن الجاف وطحنت على شكل مسحوق.

المواد الكيمائية :Chemicals:

ميتانول مطلق (شركة Fulka)، حمض الأسكوربيك وحمض الغاليك (شركة Prolabo)، كربونات الصوديوم اللامائية (شركة Surechem)، كاشف فولين سيوكالتو (شركة Fluka)، كاشف  DPPH 2,2-Diphenyl1-picrylhydrazyl)) (شركة Sigma-Aldrich).

الأجهزة المستخدمة Apparatus Used:

مقياس الطيف الضوئي (UV-VIS) من نوع  ( Jasco V-650 Spectrophotometer)  ميزان حساس، جهاز الأمواج فوق الصوتية ( ultrasound Elmasonic).

تحضير الخلاصات النباتية Extracts preparation:

وزِن1 غ من مسحوق النبات الجاف وأضيف له 20 مل من الميتانول  بُعثرت المادة جيداً ثم وضعت في جهاز الأمواج فوق الصوتية ultrasound (Elmasonic) عند درجة حرارة 40°م لمدة عشر دقائق وذلك لاستخلاص كل من الفينولات و الفلافونوئيدات من المادة النباتية. اختيرت الشروط من درجة حرارة و زمن الاستخلاص وفقاً لدراسة(En-Qin Xia et al., 2012)  [10]. أعيدت العملية ثلاث مرات، جمعت العينات الثلاث. تمّ التخلّص من الميتانول بوساطة المبخّر الدوّار rotary evaporator. واستمر التبخير حتّى الحصول على خلاصات جافة. حفظت في مكان جاف ومظلم بدرجة حرارة الغرفة حتى الاستعمال. حُسب مردود الاستخلاص من العلاقة: وزن المستخلص الخام ×  100/ وزن العينة المستخلص منها.

تحدبد محتوى الفينولات الإجماليTotal phenolic amount:

استعملت طريقة فولين لتعيين الفينولات الكلية، حيث تُرجع الفينولات حمض فسفوموليبدات التنغستين في وسط قلوي فينتج عنه محلول أزرق اللون يقاس امتصاصه عند طول موجة 765 نانومتر، حيث تحدث سلسلة من تفاعلات الإرجاع بانتقال إلكترون أو اثنين من الفينولات تؤدي إلى تكوين معقدات زرقاء اللون تضم الأنيون (PMoW11O40)^-4. استخدمت طريقة (Waterhouse, 2001) حيث وُضع 20 مكل من العينة مع 1.58 مل ماء مقطر و300مكل كربونات الصوديوم اللامائية (20% و/ح) و100مكل من كاشف فولين- سيوكالتو، مزجت جيداً ثم تركت في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة مدة 45 دقيقة، قيست الامتصاصية عند 765 نانومتر مقارنة بعينة شاهدة باستعمال المطيافية الضوئية  Spectrophotometer جدول(1). عينت الفينولات الكلية بدلالة منحنى عياري خطي لحمض الغاليك Gallic acid في الميتانول بتراكيز عديدة من 0 إلى 500 ppm، وقدرت النتائج بمكافئات من حمض الغاليك لكل 1 غ من الخلاصة الجافة. تم تعيين القيمة الوسطية للامتصاصية لثلاثة مكررات الشكل(2) [11].

تحديد الفلافونوئيدات الكلية  Determination of total flavonoids:

استخدمت طريقة (Abdeltaif et al., 2018) حيث وُضع 1مل من العينة مع 1 مل ثلاثي كلور الألمنيوم (2% في الميتانول)، مزجت جيداً ثم تركت في مكان مظلم درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة، قيست الامتصاصية عند 464 نانومتر (بعد تحديد طول موجة الامتصاص الأعظمي) مقارنة بعينة شاهدة، باستعمال المطيافية الضوئية جدول(2). عُينت الفلافونوئيدات الكلية بدلالة منحنى عياري خطي للكيرستين Quercetin في الميتانول بتراكيز عديدة من 0 إلى 40ppm الشكل(3)، وقدرت النتائج بمكافئات من الكيرستين لكل 1 غ من الخلاصة الجافة. عيّنت القيمة الوسطية للامتصاصية لثلاثة مكررات [12].

دراسة الفاعلية الكانسة للجذور الحرة باستخدام اختبار DPPH

: Free Radical Scavengering using DPPH test

استخدمت طريقة (Kadaikunnan et al., 2013) حيث حُضِّرت سلسلة من عدة تراكيز من المستخلصات والايتانول، وُضع 300 مكل من المحلول المحضر في أنبوب اختبار، ثم أُضيف إلى كل أنبوب 3 مل من محلول DPPH

(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) في الايتانول (45 مكغ/مل)، وُضعت الأنابيب بعد التحريك في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة، ثم قيست الامتصاصية باستعمال المطيافية الضوئية Spectrophotometer عند طول الموجة 518 نانومتراً (بعد تحديد طول موجة الامتصاص الأعظمي). عرضت النتائج مقارنة بالسلسلة العيارية لحمض الإسكوربيك بتراكيز بين 0.009 و0.175 ملغ/مل بوصفه مركباً مرجعياً لاختبار تثبيط الجذور الحرة بسبب قدرته الارجاعية الكبيرة، واستُعمل القانون لحساب قدرة الخلاصات على تثبيط الجذور الحرة[13].

100   X        [(Ab-Aa)/Ab]   =         %IDPPH

حيث: Aa امتصاصية العينة، Ab امتصاصية العينة الشاهدة (الايتانول+ DPPH).

يوضح الشكل رقم (4) أن النسبة المئوية للتثبيط تزداد بزيادة التركيز.

دراسة الإحصائية Statistical Analysis:

أجريت الاختبارات بمعدل ثلاثة مكررات، وعرضت النتائج على شكل المتوسط ±الانحراف المعياري. استخدم اختبار T-Test  لملاحظة الفروق الإحصائية.

النتائج Results:

تحديد مردود الاستخلاص Determination of extraction yield:

كان مردود الأوراق 36% والأزهار21%.

تحديد الفينولات الكلية Determination of total phenols:

بلغ المحتوى الفينولي للأوراق: 55.24±1.05 ملغ مكافىء حمض الغاليك / غ خلاصة جافة، الأزهار: 75.39±0.69 ملغ مكافىء حمض الغاليك / غ خلاصة جافة.

تحديد الفلافونوئيدات الكلية Determination of total flavonoids:

كان المحتوى الفلافووئيدي للأوراق 6.62±0.023 ملغ مكافىء كيرستين / غ خلاصة جافة والمحتوى الفلافووئيدي للأزهار11.57±0.047 ملغ مكافىء كيرستين / غ خلاصة جافة.

دراسة الفاعلية الكابحة للجذور الحرة باستخدام اختبار DPPH

 Free Radical Scavengering using DPPH test

يبين الجدول رقم (4) التركيز المثبط لـ 50% من محلول (IC50) DPPH لكل من الأوراق والأزهار بالمقارنة مع حمض الأسكوربيك، حيث إن القدرة  الكابحة للجذور الحرة تزداد كلما نقصت قيمة IC₅₀.

الدراسة الإحصائية و العلاقة بين التأثير الكاسح للجذور الحرة و المحتوى الكلي الفينولي و الفلافونوئيدي

أظهرت الدراسة الإحصائية عدم وجود فروق إحصائية بين قيم المحتوى الفينولي و الفلافونوئيدي والتأثير الكاسح للجذور الحرة للخلاصات الميتانولية للأوراق و الأزهار P>0.05 ع. لدى مقارنة معامل الارتباط R² للمحتوى الكلي من الفينولات تبين وجود علاقة بين التأثير الكاسح للجذور الحرة و المحتوى الفينولي للخلاصة الميتانولية للأوراق والأزهار (R²=1).

المناقشة Discussion:

اسُتخدمت طريقة الاستخلاص بالسوائل الحرجة بواسطة ثاني أوكسيد الكربون في الدراسة لتحضير خلاصات لأزهار نبات ذهب الشمس أجراها (Poli et al., 2013) في شروط مختلفة من درجة الحرارة فكان أفضل مردود استخلاص للأزهار  6.31%^[14]. أما في الدراسة الحالية فقد بلغ مردود الخلاصة الميتانولية للأزهار 21% و للأوراق 36% و مما يدل أن استخدام الأمواج فوق الصوتية للاستخلاص Ultrasound-assisted extraction أدى إلى رفع فعالية الاستخلاص. كما نلاحظ أن مردود الاستخلاص للأوراق أعلى من الأزهار. أظهرت الدراسة الحالية أن محتوى الفينولات الكلي للخلاصة الميتانولية لكل من الأوراق و الأزهار مرتفع رغم تفوق الأزهار. وبالعودة للدراسة التي أجريت من قبل (Rigano et al., 2014) نجد أن محتوى الفينولات الكلي للخلاصة الايتانولية 95%  للأزهار بلغ 132.1ملغ/غ . يمكن أن يعزى الاختلاف إلى اختلاف محل الاستخلاص لاختلاف البيئة ^[6]. أما فيما يتعلق بالأوراق فلم نجد دراسة تشير إلى المحتوى الكلي للفينولات لأوراق النبات. أشارت الدراسات السابقة أن الخلاصات القطبية لأزهار نبات ذهب الشمس غنية بالمركبات الفينولية.  من هذه المركبات مركب أرزانول Arzanole والذي يعزى إلبه التأثير المضاد للالتهاب anti-inflammatory، كما تحتوي على مركب الريسفيراتولresvetrol و مشتقات اسيتوفينون  مثل مركب  4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)acetophenone ^[6]. من جهة أخرى فإن المحتوى الفلافونوئيدي للأزهار أعلى من الأوراق على الرغم من تقارب التركيز في الخلاصتين.  تشير الدراسات السابقة إلى وجود العديد من المركبات فلافونوئيدية الحرة مثل اليتونين luteolin، أبيجين apigenin، نارجينين naringenin، غنافاليين gnaphaliin و غليكوزيدات فلافونوئيدية مثل غليكوزيل أبيجينين glycosyl-apigenin و غليكوزيل نارجينين glycosil-naringenin. تملك هذه المركبات تأثيراً مضاداً للأكسدة و مثبطاً أنزيمياً و غير أنزيمي لليبيد بيروأوكسيدازlipid peroxidation^[6]. وعلى الرغم من ذلك لم تتطرق أي من الدراسات السابقة إلى معايرة المحتوى الكلي للفلافونوئيدات في أي من أجزاء النبات. أما فيما يتعلق بقياس القدرة الكاسحة للجذور الحرة نلاحظ تفوق الأزهار على الأوراق يمكن أن يعزى ذلك لاختلاف التركيب الكيميائي ونسبة الفلافونوئيدات و الفينولات كما أظهرت الدراسة وجود ارتباط بين كل من المحتوى الفينولي و الفلافونوئيدي من جهة و التأثير الكاسحة للجذور الحرة. وفي الدراسة التي أجراها (Kramberger et al., 2020)  نلاحظ أن القدرة الكاسحة للجذور الحرة المحتوى الكلي للفينولات تختلف باختلاف المحل المستخدم للاستخلاص و طريقة تحضير لخلاصة النبات، حيث تراوح المحتوى الكلي للفينولات 5.7 – 104ملغ مكافىء حمض الغاليك/غ خلاصة جافة، أما القدرة الكاسحة للجذور الحرة فتراوحت بين 15-286 مكغ/مل. لكن هذه الدراسة لم تميز بين الأوراق والأزهار حيث استُخلص كامل النبات^[14].

الاستنتاجات Conclusion:

يعدّ نبات ذهب الشمس من النباتات المهمة والتي شاع استخدامها مؤخراً بوصفه نباتاً طبياً أو نبات زينة، إن خلاصات أزهار وأوراق هذا النبات تحتوي على نسب جيدة من الفينولات و الفلافونوئيدات و التي تملك قدرة جيدة بوصفها مضادّ أكسدة، وبالتالي الاستفادة منها في الوقاية من الأمراض الناتجة عن الأكسدة والجذور الحرة مثل أمراض الأعصاب التنكسية neurodegenerative diseases مثل داء الزهايمر Alzheimer’s disease وداء باركنسون Parkinson’s disease كما تفيد في علاج والوقاية من الأورام الخبيثة Malignant tumors.

المراجع :

[1] Dai J, Mumper RJ. Review: Plant phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules. 2010. 15(10):7313–7352.

[2] Benvenuti S, Pellati F, Melegari M, Bertelli D. Polyphenols, Anthocyanins, Ascorbic Acid, and Radical Scavenging Activity of Rubus, Ribes, and Aronia. Journal of Food Science. 2004. 69(3):164–169.

[3] Van Acker SAB., van Balen GP, van den Berg D, Bast A, van der Vijgh WJ. Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids. Biochem. Pharmacol. 1998. 56: 935–43.

[4] Tsao R. Review: Chemistry and biochemistry of dietary polyphenols. Nutrients. 2010. 2(12):1231–1246.

[5] Galbany-Casals M., Blanco-Moreno J.M., Garcia-Jacas N., Breitwieser I., Smissen R.D., Genetic variation in Mediterranean Helichrysum italicum (Asteraceae; Gnaphalieae do disjunct populations of subsp. microphyllum have a common origin?). Plant Biol. 2011. (13) 678–687.

[6] Ninčevića T., Grdiša M., Šatović Z., Jug-Dujaković M., Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Taxonomy, biological activity,biochemical and genetic diversity. Industrial Crops & Products. 2019. 138 , 111487.

[7] Chinou, I.B., Roussis, V., Perdetzoglou, D., Loukis, A., 1996. Chemical and biological studies on two Helichrysum species of Greek origin. Planta Med. 62, 377–379.

[8] Hellivan, P.J., 2009. Immortelle’s sustainable resurgence. Perfum. Flavor. 34, 34–40

]9] AntunesViegas D., LígiaSalgueiro A., Martinez-de-Oliveira J., Palmeira-de-Oliveira R. Helichrysumitalicum: From traditional use to scientific data. Journal of Ethnopharmacology. 2014. 151, 54–65.

[10] Xia EQ, Yu YY, Xu XR, Deng GF, Guo YJ, Li HB. Ultrasound-assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid from Ligustrum lucidum Ait. Ultrason Sonochem. 2012. 19(4):772-6.

[11] Waterhouse A.L. Determination of Total Phenolics. In: Wrolstad, R.E., Ed., Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 2001; I1.1.1-I1.1.8.

[12] Abdeltaif S.; SirElkhatim K.; Hassan A.; Estimation of Phenolic and Flavonoid Compounds and Antioxidant  Activity of Spent Coffee and Black Tea (Processing) Waste for Potential Recovery and Reuse in Sudan .” Recycling. 2018, 3, 27.

[13] Kadaikunnan S; Rejiniemon T; Alharbi1 N; Khaled J; Agastian P; Identification And Quantification Of Phenolic Compounds From Trigonella Foenum Graecum L. And Its In-Vitro Antioxidant, Anticancer And Antimicrobial Activities.  Fresenius Environmental Bulletin. 2015, 24, (8A):2643-2649

[14] Poli F., Muzzoli M., Sacchetti G., Tassinato G., Lazzarin R., Bruni A., Antioxidant activity of supercritical CO2 extracts of Helichrysum italicum. Pharm. Biol. 2003. 41, 379–383.

[15] Kramberger K, Barlič-Maganja D, Bandelj D, Baruca Arbeiter A, Peeters K, Miklavčič Višnjevec A, Jenko Pražnikar Z. HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS Determination of Bioactive Compounds and Antioxidant Activity Comparison of the Hydroalcoholic and Water Extracts from Two Helichrysum italicum Species. Metabolites. 2020.10(10), 403.