في هذه الدراسة، قيمت الخصائص المضادة للأكسدة والمضادة للجراثيم بالإضافة لمقايسة المحتوى الفينولي والفلافونيدي في أزهار نباتL. C. coronarium الذي ينمو في سورية. حضرت ثلاثة مستخلصات لأزهار النبات (المستخلص المائي والمستخلص الميثانولي ومستخلص خلات الإيتيل)، وقد بينت النتائج أن مستخلص خلات الإيتيل يحتوي على أعلى مستويات للفينولات والفلافونيدات حيث كانت على التتالي 5680 و2030 ملغ/100غ خلاصة جافة، أما اختبار الفعالية المضادة للأكسدة فقد بين أن أعلى قدرة مضادة للأكسدة كانت لدى استخدام مستخلص خلات الإيتيل 81 ، في حين أن اختبار مضاد البكتريا بين تفاوت المستخلصات في الفعالية يعود لاختلاف المحلات في قدرتها على استخلاص المواد الفعالة ولاختلاف السلالات البكتيرية في حساسيتها تجاه المواد الفعالة حيث كانت البكتريا سالبة الغرام أقل حساسية ولاسيما بكتريا E. coli.
المقدمة Introduction
يعد استخدام النباتات الطبية والأدوية المحضرة منها تقليدًا قديمًا، وقد حفز التقدم العلمي في العلاجات الحديثة استخدام المنتجات الطبيعية في جميع أنحاء العالم لعلاج الأمراض والحالات المرضية المتنوعة. تشير الدراسات إلى أن المنتجات الطبيعية ومشتقاتها تمثل أكثر من 50% من جميع الأدوية المستخدمة في الرعاية الصحية(Miraj and Alesaeidi, 2016)، كما أن تنوع المركبات الطبيعية في الأعشاب ووظائفها المختلفة في الوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها من ناحية، إلى جانب خصائصها المتمثلة في كونها طبيعية وملائمة للجسم وليس لها آثار ضارة شريطة استخدامها بشكل سليم، يجعل الناس يقبلون على استهلاكها، وبالتالي فإن الناس المهتمين والمتخصصين في الرعاية الصحية لديهم اهتمام كبير بتركيز الدراسات على هذه النباتات الطبية وتشخيص خصائصها العلاجية ( Miraj and Alesaeidi, 2016).
وبالتالي فإن هناك اهتمام مستمر من قبل الباحثين لدراسة النباتات الطبية التي لم تدخل دائرة الاهتمام ومنها نبات الأقحوان الذهبيL. Chrysanthemum coronarium و النبات هو أحد أنواع الفصيلة النجمية Asteraceae وهو نبات عشبي حولي موطنه الأصلي مناطق البحر الأبيض المتوسط، ويتم إدخاله وزراعته أحياناً في أماكن أخرى و يحظى النبات بتقدير كبير كغذاء في اليابان والصين، وقد تم الإشارة إلى العديد من الخصائص البيولوجية المتعلقة بالغذاء وخاصة كمضاد للأكسدة و الجراثيم والفطريات ومضاد للسرطان وتُعزى هذه الخصائص الوظيفية إلى مجموعة واسعة من المكونات الفعالة بيولوجيًا) Hosni, et al., 2013 (. كما تمت الإشارة إلى مساهمة المنتجات الثانوية وخاصة الزيوت العطرية والفلافونيدات في جزء من هذه الفعالية البيولوجية. ويعتبر النبات مصدراً غنياً بالمكونات الفينولية ذات الفعالية البيولوجية المتنوعة حيث ثبت وجود ثلاثة مشتقات من حمض الكينيك ذات الفعالية المضادة للأكسدة. وقد تقاطعت أراء العديد من الباحثين على أن التركيب الكيميائي للزيت العطري والمركبات الفينولية لنبات C. coronarium L معرضان بشكل خاص للتغيرات الكمية والنوعية تبعاً لتغير النمط الوراثي والموقع الجغرافي والعوامل البيئية. كما تمت الإشارة إلى أن أزهار النبات قد استخدمت كمواد لغش أزهار البابونج وفي اليابان تستخدم الأوراق في إخماد روائح السمك في الأطعمة الجاهزة (Alvarez-Castellanos, et al., 2001). وفي الأردن تستخدم أزهار النبات في علاج الأمراض الجلدية والديدان المعوية (Bardaweel, et al., 2015).
تعد أبحاث مضادات الأكسدة من بين الأبحاث التي باتت تشغل حيزاً هاماً من اهتمام الباحثين بشكل عام، حيث أن المواد المضادة للأكسدة توجد في الأغذية أو في النظام البيولوجي بتركيزات منخفضة مقارنة بالمواد المؤكسدة وهي تؤخر أو تمنع عملية الأكسدة. إن دراسة مضادات الأكسدة الطبيعية، بما في ذلك الزيوت الأساسية (EOs)، مهمة نظرًا لاستخداماتها في الغذاء والأدوية ومستحضرات التجميل (Fırat, et al., 2018).
وفي الجزائر درست فعالية مستخلصات نبات C. coronarium L. كمضادات أكسدة حيث أظهر التحليل الكيميائي أظهر وجود مركبات رئيسية معروفة من المركبات الفينولية والفلافونيدات والعفص والصابونين والتربينات والكينونات والستيرؤيدات والقلويات والنشا والصمغ مع غياب الغليكوزيدات(Belhachat,etal.,2023)، كما أظهر تحليل المستخلص الميثانولي فعالية استخلاص أعلى مقارنة بالمستخلص الايتانولي والمائي، وأظهر تحديد المحتويات الفينولية قيمة كبيرة.
تشير الأبحاث فيما يتعلق بفعالية نبات Matricaria recuitta المضادة للأكسدة أن المستخلصات من رؤوس أزهار وأوراق البابونج هي مصدر غني للنشاط المضاد للأكسدة ومن بين مركباتها bisabolol وchamazulene والتي أعطت أعلى فعالية (Miraj and Alesaeidi,2016).
هدف البحث:
تقييم كفاءة المذيبات المختلفة القطبية في استخلاص المواد الفعالة (الفينولات والفلافونيدات) التي تملك فعالية كمضادات أكسدة من أزهار نبات C. coronarium L. وإلى دراسة الفعاليات الحيوية للمستخلصات الناتجة من حيث القدرة المضادة للأكسدة والفعاليات المضادة للجراثيم.
المواد والطرائق Materials and Methods
المادة النباتية:
جُمعت النورات الزهرية لنبات C. coronarium L. خلال مرحلة الإزهار الكامل، من منطقة المنية من محافظة طرطوس. وهي منطقة سهلية تمتد مابين الشريط الساحلي والجبال الساحلية (صافيتا)، تمتاز المنطقة بتربة خصبة، ترتفع المنطقة عن سطح البحر22م. يبلغ معدل الهطول المطري840 مم سنوياً، ومعدل درجة الحرارة الصغرى 8.68°م ومتوسط درجة الحرارة العظمى 30.53 °م وتبلغ قيمة معامل أمبرجيه Q2 =131.39 أي الموقع ضمن الطابق البيومناخي شبه الرطب. جففت العينات في الظل لمدة 10أيام وعلى درجة حرارة الغرفة لضمان التجفيف الكامل. وقد تمّ تصنيف النبات في كلية العلوم –جامعة دمشق.
المواد الكيمائية:
ماء مُقطّر، ميثانول مُطلق (Merck)، خلات الإيثيل (Merck)، عياري حمض الغاليك (من شركة AVONCHEM)، عياري الكيرستين (من شركة Sigma-Aldrich)، كربونات الصوديوم (من شركة Scharlau)، كلوريد الألمنيوم (من شركة Scharlau) كاشف فولين سيكالتو (من شركة Sigma-Aldrich)، DPPH (من شركة TCI).
الأجهزة والأدوات المستخدمة:
ميزان حساس (Kern)- مُبخّر دوّار (Heidolph) – المطحنة الكهربائية و جهاز التسخين المائي كلاهما صناعة محلية.
تحضير الخلاصة:
– لتحضير المستخلصين الكحولي وخلات الإيتيل: تم أخذ100 غ من الأزهار المجففة المطحونة وأضيف لها 500 مل من أحد المذيبين الكحول الميتيلي أوخلات الإيتيل كلاً على حدة، وترك المنقوع لمدة 12 ساعة على درجة حرارة الغرفة العادية. وسخنت مع التحريك لمدة 6 ساعات تحت مبرد صاعد ثم تم الترشيح باستخدام ورق الترشيح (whatman, No. 0.2 )، واستخدم بعدها جهاز المبخر الدوراني لفصل المستخلص عن المحل عند درجة حرارة °40م. حفظ المستخلص في عبوات زجاجية داكنة اللون في البراد عند درجة حرارة °4م لحين الاستخدام.
تقدير الفينولات الكلية:
قُدر محتوى الفينولات الكلية لمستخلصات أزهار C. coronarium L بالطريقة الطيفية باستخدام كاشف فولن-سيوكالتو وفقاً لطريقة Albayrak وآخرون (2010)، حيث حُضرت المستخلصات بتركيز 1 ملغ/مل ثم أخذ من كل منها 40 ميكرو ليتر ومزجت مع 2.4 مل من الماء المقطر، ثم أضيف 200 ميكرو ليتر من كاشف فولن-سيوكالتو ومزجت المحتويات بشدة، وبعد دقيقة واحدة، أضيف 600 ميكرو ليتر من كربونات الصوديوم (20%)، وأكمل الحجم إلى 4 مل بالماء المقطر، وبعد ساعتين من الحضن في درجة حرارة الغرفة، قيست الامتصاصية عند طول موجة 765 نانومتر، وأجريت مقارنة القراءة بالمنحني المعياري لحمض الغاليك المحضر بتراكيز 20، 40، 60، 80 و100 ملغ/مل. وعُبر عن النتائج بواحدة ملغ مكافئ لحمض غاليك/100 غ وزن جاف (خلاصة)± الانحراف المعياري.
تقدير الفلافونيدات الكلية:
قُدر محتوى الفلافونيدات الكلية في مستخلصات أزهار C. coronarium L بالطريقة الطيفية، حيث أخذ 10 ملغ من كل من المستخلصات المحضرة، بدايةً أذيبت المستخلصات في الإيتانول(80%) للحصول على تركيز 0.1 ملغ/مل، وبعدها أخذ حجم 0.5 مل من كل منها ومزج بالمحاليل الآتية: 5 مل من الإيثانول (95%)، و0.1 مل من كلوريد الألمنيوم (10%)، وأضيف إليها 0.1 مل من خلات البوتاسيوم (1 مول/لتر) و2.8 مل ماء مقطر، وتم التحضين لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة، وسجلت الامتصاصية عند طول موجة 415 نانومتر، استعمل الكيرستين المحضر بتراكيز 5، 10، 15، 20، 25 ملغ/مل لإعداد المنحني المعياري. وعُبر عن النتيجة بـ ملغ كيرسين/100 غ وزن جاف(خلاصة)± الانحراف المعياري (Chang et al., 2002).
الفعالية المضاد للأكسدة: DPPH
قُدِّرت الفعالية المضاد للأكسدة لمستخلصات أزهار C. coronarium L من خلال تقدير فعالية المستخلصات الكاسحة لجذر DPPH (2،2-ثنائي فينيل-1-بيكريل هيدرازيل) الحر (Albayrak et al., 2010)، حيث حُضرت المستخلصات الفعَّالة وفق عدة تراكيز تراوحت من 0.1 إلى 2 ملغ/مل في محلول Tris-HCl الواقي (pH=7.4)، ثم أُخذ 50 ميكرو ليتر من كل من هذه التراكيز ومزج مع 1 مل من محلول DPPH الميثانولي (0.1 ميلي مول). استخدم الميثانول كشاهد بدلاً من المستخلصات. ترك المزيج لمدة 30 دقيقة بدرجة حرارة الغرفة وقيس الامتصاص عند طول موجة 517 نانو متر (Optizen 3000 plus, Korea). عُبر عن الفعَّالية الكاسحة لجذر مركب DPPH بشكل نسبة مئوية لتثبيطه وفق المعادلة الآتية:
الفعالية المضاد للجراثيم:
العزلات البكتيرية المستخدمة في البحث:
أجري البحث على سبع عزلات من البكتريا، وهي أربعة أنواع إيجابية الغرام: المكورات العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus (S. aureus) ومكورات عنقودية بشروية Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) والعصية الرقيقة Bacillus subtilis (B. subtilis) العصية الشمعيةBacillus cereus (B. cereus).
وثلاثة أنواع سالبة الغرام: الإشيرشيا الكولونية Escherichia coli (E. coli)، الكلبسيلا الرئوية Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) والزائفة الزنجاريةPseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ومصدرها الهيئة العامة للتقانة الحيوية-قسم التقانات الغذائية والصناعية-دمشق.
أجري تخطيط العزلات على أطباق مولر هنتون اغار MHA وتحضين الأطباق بحرارة 37°م لمدة 24 ساعة، ثم اختيار المستعمرات المعزولة جيداً لتحضير معلقات البكتريا. وحضر معلق من كل عزلة بتركيز 0.5 ماكفارلاند بالقياس بواسطة جهاز العكارة الآلي. وحضرت تراكيز 5، 6.25، 10، 20، 40، 80، 160 ملغ/مل من المستخلصات المجففة باستخدام الماء، الميتانول، خلات الايتيل كلاً على حدة مع إضافة DMSO المعقم بالترشيح (مرشح معقم قطر ثقوبه 0.20 مكم) بنسبة 0.5% لإذابة المستخلصات ويكمل الحجم إلى 95 مكل بواسطة مرق مولر هنتون (MHB). وأضيف 5 مكل من معلق البكتريا إلى كل أنبوب، وحضنت الأنابيب بعد الرج بدرجة الحرارة المناسبة للنمو (37°م) لمدة 24 ساعة، واستخدم مرق مولر هنتون مع DMSO (0.5%) بدون إضافة المستخلصات كشاهد. وتم حساب قيمة التركيز الأدنى القاتل للبكتريا (MBC): بعد انتهاء فترة التحضين، نقل 10 مكل من كل أنبوب ويزرع على طبق بتري يحوي وسط مولر هنتون أغار (MHA)، وحضنت الأطباق الملقحة بحرارة 37°م لمدة 24 ساعة. وسجل ظهور نمو مرئي للمستعمرات (أو غيابه) على أطباق MHA بعد التحضين. وسجل أقل تركيز من المستخلص الذي يؤدي إلى عدم ظهور مستعمرات مرئية على أطباق MHA على أنه هو قيمة MBC.
مكان تنفيذ البحث:
أنجز البحث في مخابر الهيئة العامة للتقانة الحيوية-قسم بحوث التقانات الغذائية وقسم بحوث النباتات الطبية والعطرية في الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية ومخابر جامعة دمشق.
النتائج والمناقشة Results and Discussion
الفينولات الكلية والفلافونيدات الكلية:
– خطّيّة حمض الغاليك Gallic acid linearity
يُبيّن (الشكل 1) الخط البيّاني الممثل لخطّيّة حمض الغاليك، والذي يُظهر متوسط المُكررات الثلاثة لقيم الامتصاص الموافق لكلّ تركيز مع تراكيز السلسلة العياريّة. حيث نلاحظ أنّ الطريقة المُتبعة تتمتّع بخطّيّة ممتازة وبقيمة مُعامل ارتباط R2=0.998
الشكل (1): خطّيّة حمض الغاليك
– خطّيّة الكيرستين Quercetin linearity
يُبيّن (الشكل 2) الخط البيّاني الممثل لخطّيّة الكيرستين، والذي يُظهر متوسط المُكررات الثلاثة لقيم الامتصاص الموافق لكلّ تركيز مع تراكيز السلسلة العياريّة. حيث نلاحظ أنّ الطريقة المُتبعة تتمتّع بخطّيّة ممتازة وبقيمة مُعامل ارتباط R2=0.99
الشكل (2): خطّيّة الكيرستين
تم تحديد محتوى أزهار C. coronarium L من الفينولات باستخدام ثلاثة مستخلصات. يُبيّن الجدول التالي (الجدول 1) محتوى الفينولات الكُلّيّة في العينات المدروسة، حيث تمّ تعويض متوسط المُكررات الثلاثة للامتصاص في معادلة الخط البياني الناتج عن خطية حمض الغاليك:
y = 0.0113x + 0.0321
يُبيّن الجدول (الجدول 1) أيضاً محتوى الفلافونوئيدات في العينات المدروسة، حيث تمّ تعويض متوسط المُكررات الثلاثة للامتصاص في معادلة الخط البياني الناتج عن خطية الكيرستين:
y = 0.0074x + 0.0119
من الجدول (1) يتبين لنا أن النتيجة تراوحت في المستخلصات المختلفة من 3400 إلى 5680 ملغ مكافئ/100غ وزن جاف. لقد بلغت أعلى قراءة 5680 ملغ /100غ لدى استخدام خلات الإيتيل في حين سجل الماء أقل فعالية مقارنةً بالكحول الميتيلي وخلات الإيتيل وقد تكررت نتيجة تفوق خلات الإيتيل في فعالية الاستخلاص لدى تقدير كمية الفلافونيدات حيث تراوحت القراءة من 1120 إلى 2030 ملغ /100 غ وهذا يتوافق مع (Jamelh and Tlay,2023) حيث بينت النتائج ضعف فعالية الماء المقطر مقارنة مع الهكسان المطلق والكلوروفورم المطلق والميثانول المطلق في استخلاص الفينولات والفلافونيدات من جذر العرقسوس، كما درس (Kennouche, et al., 2016) نباتChrysanthemum segetum من فلورا الجزائر حيث سجل تفوق خلات إيتيل مقارنةً بالكلوروفورم والميتانول في استخلاص الفينولات والفلافونيدات في حين أن Mahdi, et al.,2023)) أوضح أن المستخلص المائي لأزهار نبات C. coronarium L قد حقق أعلى نتيجة لدى تحضير مستخلصات باستخدام (الماء والميثانول و الأثير البترولي) في حين سجّل مستخلص الأثير البترولي أدنى تركيز لمحتوى الفينولات والفلافونيدات.

نتائج الفعالية المضادة للأكسدة لمستخلصات أزهار C. coronarium L:
جذر DPPH هو مركب كيميائي يستخدم بشكل متكرر يستخدم في التجارب المعملية لتقييم الفعالية المضادة للأكسدة لمختلف المواد، وهو عبارة عن جذر حر مستقر يتميز باللون الأرجواني الغامق ويمتلك إلكترونًا غير مزاوج، مما يجعله ذو تفاعلية عالية. تعمل مضادات الأكسدة على تقليل DPPH بشكله الحر عن طريق التبرع بالإلكترون، مما يتسبب في تغير اللون ويقاس اللون الأزرق للمركب الأصلي بطول موجة 517nm والذي يمكن قياسه باستخدام القياس الطيفي الضوئي، يتناسب مدى هذا التغير اللوني طرديًا مع النشاط المضاد للأكسدة للمركب المختبر (Doan et al.,2024)

توضح النتائج المبينة في الجدول (2) وجود دور فعال لنوع المذيب المستخدم في الفعالية المضادة للأكسدة لمسحوق أزهار نبات C. coronarium ويظهر هذا التأثير بشكل واضح في جميع المذيبات المستخدمة حيث تفوق مستخلص خلات الإيتيل فقد بلغت النسبة المئوية للتثبيط 81% في حين كانت أقل نسبة للتثبيط لدى استخدام الماء فقد بلغت نسبة التثبيط 66% وهذا يتوافق مع ما توصل إليه في مصر (Donia,201 4) فقد تفاوتت نسبة التثبيط باختلاف المحل المستخدم وكانت أفضل فعالية لدى استخدام محلول خلات الإيتيل (49.45%) في حين كانت أقل نشاط مضاد للأكسدة (14.50%) لدى استخدام ثنائي إيتيل الأثير. بمقاطعة النتائج الواردة في الجدول (1) و(2) نلاحظ أن المحتوى الفينولي والفلافونيدي خاصةً كان أعلى لدى استخدام خلات الإيتيل ومع ذلك فقد كانت قراءة الفعالية الكاسحة للجذور الحرة متقاربة مما يدل على وجود مركبات أخرى مسؤولة عن التأثير الكاسح للجذور الحرة غير فينولية.
الفعالية المضادة للجراثيم:
من خلال النتائج المدرجة والموضحة في الجدول رقم (3) التي تبين فعالية مستخلصات أزهار C. coronarium على الأنواع البكتيرية المدروسة يتبين أنه هناك فعالية للمستخلصات المحضرة وقد اختلفت كفاءتها بالدرجة الأولى باختلاف المحل المستخدم حيث نلحظ انخفاض فعالية المستخلص المائي مقارنة بمستخلصات الميتانول وخلات الإيتيل، يوضح الجدول التركيز القاتل (ملغ/مل) ضد أنواع من البكتيريا، وهذا يتوافق مع (Belhachat, et al.,2023) حيث أظهر التحليل أن المستخلص الميثانولي أظهر استخلاصاً أعلى في الحصول على المحتويات الفينولية بالمقارنة مع المستخلص الإيثانولي والمستخلص المائي كما كشف تحديد محتويات الفلافونيد أن المستخلص الميثانولي احتوى على أعلى قيمة مقارنة بالمستخلص الايتانولي والمستخلص المائي. ما نلحظ من خلال النتائج الواردة في الجدول (3) أن مستخلصات نبات C. coronariumكانت أكثر فعالية تجاه البكتريا موجبة الغرام فقد تراوحت قيم (MBC) مابين 5-10، في حين تراوحت قيم (MIC) لدى استخدام المستخلصات على العزلات السالبة الغرام مابين 10-40 وهذا يتوافق مع نتائج Bardaweel, et al., 2015) ( حيث اختبروا الفعالية المضاد للميكروبات للزيت العطري لنبات C. coronarium وأُظهرت النتائج فعالية ضد البكتيريا موجبة الجرام بينما فشل في تثبيط نمو البكتيريا سالبة الجرام. وهذا قد يعود لأن البكتيريا موجبة الجرام أكثر حساسية من البكتيريا سالبة الجرام حيث يُعتقد أن وجود حاجز غشائي خارجي مانع في البكتيريا سالبة الجرام هو السبب الرئيسي للمقاومة الجوهرية التي تمتلكها البكتيريا سالبة الجرام تجاه العلاجات المضادة للبكتيريا. وفي العموم فقد كانت E. coli أقل العزلات المدروسة حساسية لمستخلصات نبات C. coronarium، في حين كانت Staphylococcus aureus و Bacillus subtilis وBacillus cereus أكثرها حساسية وهي عزلات موجبة لغرام.

ووفقاً (Abdul Karim, et al., 2024) تحتوي المستخلصات النباتية على كميات كبيرة من المركبات الفعالة بيولوجيا وخاصة المركبات الفينولية التي تعمل على تثبيط نمو الاحياء المجهرية وخاصة البكتيريا وذلك من خلال تغير شكلها اذ تسبب ضرراً لجدران الخلايا وتؤثر على تكوين الأغشية الحيوية كذلك تؤثر المركبات الفينولية على التخليق الحيوي للبروتين وتؤثر على عمليات التمثيل الغذائي في خلايا البكتيريا وتمنع تخليق ATP والحامض النووي.
الاستنتاجات Conclusions
يعد نبات الأقحوان الذهبي من النباتات الغنية بمضادات الأكسدة ولاسيما في الأزهار وعليه يجب أن يكون النبات على قائمة النباتات التي يجب استثمارها لهذه لغاية، ولتحقيق هذا الهدف المنشود يجب التركيز على نوع المحلات العضوية المستخدمة بهدف تحقيق أقصى فائدة ممكنة وهنا ننصح بخلات الإيتيل كمحل فعال لذلك.
الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة Ethics approval and consent to participate
غير قابل للتطبيق.
تضارب المصالح Conflict of interests
يُقرّ المؤلفون بعدم وجود مصالح مُتضاربة.
التمويل Funding
مُوِّل هذا البحث من قبل الباحثين والهيئة العامة للتقانة الحيوية.
مساهمات المؤلفين Author’s contributions
عمل فريق بحثي مشترك بالكامل في جميع الخطوات.
المراجع :1- Abdul Karim, S., S. Al-Hilifi , S. Sabih George.(2024). Phenolic compounds in plants: extraction, analysis and biological activity, HNSJ 5(8).
2- Albayrak,S., Aksoy, A., Sagdic, O and Budak, U. (2010). Phenolic compounds and antioxidant and antimicrobial properties of Helichrysum species collected from eastern Anatolia, Turkey. Turk J Biol, 34:463-473.
3- Alvarez-Castellanos, P., C. Bishop., M. Pascual-Villalobos.2001. Antifungal activity of the essential oil of flower heads of garland chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium) against agricultural pathogens, Phytochemistry, Vol. 57(1): 99-102.
4- Bardaweel, S., M. Hudaib, K. Tawaha, Ra. Bashatwah.2015. Studies on the In Vitro Antiproliferative, Antimicrobial, Antioxidant, and Acetylcholinesterase Inhibition Activities Associated with Chrysanthemum coronarium Essential Oil, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015, Issue 1Jan 2015.
5- Belhachat, D., R.Tidjani, A. Makhlouf, and M. Balhachat.2023. Phytochemical Screening, Composition and In Vitro Antioxidant Activity of Algerian Chrysanthemum coronarium (L.) Extracts, South Asian Journal of Experimental Biology, 2023, Vol 13, Issue 3, p158.
6- Doan, T., G. Tran, T. Nguyen, J. Lim and S. Lee. 2024. Antioxidant activity of different cultivars of Chrysanthemum morifolium and quantitative analysis of phenolic compounds by HPLC/UV. Applied Biological Chemistry, Vol67, No 17.
7- Donia, A.2014.Biological Activity of Chrysanthemum coronarium L. Extracts, Annual Research & Review in Biology,4(16): 2617-2627, 2014.
8- Chang, C. C,. Yang, M. H., Wen, H. M and Chern, J. C. (2002). Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods. Journal of Food and Drug Analysis, 10(3): 178-182.
9- Fırat, Z., F. Demirci and B. Demirci .2018. Antioxidant Activity of Chamomile Essential Oil and Main Components, Natural Volatiles & Essential Oils, 2018; 5(1): 11-16.
10- Jamelh, R., R. Tlay.2023. Studying the effect of using different polar solvents on the content of phenols, total flavonoids and antioxidant activity of licorice root powder extracts, Damascus University Journal of Agricultural Sciences Vo 39 No.2: 137 – 150.
11- Hassan, S .2010. The effect of Anise seed extracts in some microorganisms, Diyala Journal of Agricultural Sciences. 2(2): 9-17.
12- Hosni, K, I. Hassen., H. Sebei, H. Casabianca. 2013. Secondary metabolites from Chrysanthemum coronarium (Garland) flower heads: Chemical composition and biological activities, Industrial Crops and Products, Vol. 44, January 2013, Pp 263-27.
13- Kennouche, S ., S. Bicha, A. Bentamene, J. Crèche, F. Benayache and S. Benayache.2016. In Vitro Antioxidant Activity, Phenolic and Flavonoid Contents of Different Polarity Extracts from Chrysanthemum segetum L.Growing in Algeria. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research .Vol. 8(9); 1522-1525.
14- Mahdi, S., M. Abdelaal, G. El-Sherbeny, I. Mashaly, A. Yahia and S. Ramadan. 2023. Phytochemical Content, Antioxidant Activity, Essential Oils and Antibacterial Potential of Egyptian Phlomis floccosa D. Don and Glebionis coronaria (L.) Cass. ex Spach. CATRINA (2023), 27(1): 45-58.
15- Miraj, S., S. Alesaeidi.2016. A systematic review study of therapeutic effects of Matricaria recuitta chamomile (chamomile), Electron Physician. . 2016 Sep 20; 8(9):3024–3031.