المقدمة Introduction

تحدث الأذية الكلوية لدى حوالي 1-5 % من المرضى الذين يستخدمون ﻣﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻻﻟﺘﻬﺎﺏ ﻏﻴﺮ ﺍلستيرﻭئيدية، نظراً للاستهلاك الكبير لها ﻣﻦ قبل ﺍلمرﺿﻰ و تشير ﺍلدراسات ﺇﻟﻰ أن هناك ﺃكثر ﻣﻦ70  مليون وصفة طبية و 30 ﻣﻠﻴﺎﺭ ﺟﺮﻋﺔ تؤخذ ﺩﻭﻥ ﻭﺻﻔﺔ طبية ﺳﻨﻮﻳﺎً ﻓﻲ ﺍﻟﻮﻻﻳﺎﺕ المتحدة وهذا يشير ﺇﻟﻰ أن ﻣﺎ يزيد عن 2.5 مليون مريض سوف يعانون من تسمم كلوي سنوياً [1].

تشمل آثارها الضارة الشائعة القرحة المعدية المعوية، الأمراض القلبية الوعائية، والمضاعفات الكلوية وتعتبر الأذية الكلوية الحادة AKI النمط الأكثر شيوعاً للأذية الكلوية المحدثة بالـ NSAIDs [2].

تعمل مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية على تثبيط إنزيمات السيكلو أكسجيناز Cyclooxygenase  (COX) والتي تعرف باسم Prostaglandin H Synthase (PGHS) وبالتالي تثبيط اصطناع البروستاغلاندينات [2]. تتحكم البروستاغلاندينات بتأثيرها الموسع الوعائي في معدل الرشح الكبيبي وتحافظ على تدفق الدم الكلوي حيث أنها توسع الأوعية في الشرايين الكلوية الواردة وتزيد من التروية الكلوية وإن تثبيط اصطناعها من قبل الـ NSAIDs قد يؤدي إلى انخفاض معدل الرشح الكبيبي ونقص تروية كلوية ونخر نبيبي حاد [3].

يعد الديكلوفيناك مثبط غير انتقائي لإنزيمات (COX) يوصف في تدبير الألم، الحمى والالتهاب، وهو أحد الخيارات الرئيسة في تدبير الآلام الحادة والمزمنة المتعلقة بالجهاز العضلي الهيكلي بما في ذلك تدبير ألم العضلات، آلام أسفل الظهر، والتهاب المفاصل الروماتوئيدي [4]. يتحول الديكلوفيناك إلى 4′ hydroxydiclofenac بواسطة CYP2C9 و 5-hydroxydiclofenac بواسطة CYP3A4 وهذه المستقلبات تتحول إلى مركبات كينون ايمين تفاعلية قادرة على تكوين روابط تساهمية مع البروتينات الخلوية وتحفيز الإجهاد التأكسدي[5] تلعب مستقلبات الديكلوفيناك دوراً كجذور أوكسجينية تؤدي إلى تراكم الجذور الأوكسجينية التفاعلية Reactive Oxygen Species (ROS) وتؤدي إلى أكسدة الدهون والأحماض النووية والبروتينات في الأنسجة [6]. لذلك يعتقد أن العوامل المضادة للأكسدة والتي تهاجم ROS من شأنها أن تمارس تأثيراً مفيداً ضد الأذية الكلوية التي يسببها الديكلوفيناك [7].

أظهرت الدراسات أن لحموض Omega-3 تأثير مضاد للأكسدة إما بشكل مباشر عن طريق إزالة الجذور الحرة أو بشكل غير مباشر عن طريق زيادة نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة مثل Catalase (CAT)، Superoxide Dismutase  (SOD)، Glutathione Peroxidase (GPX) [8].

فقد تمَّ تقييم التأثير الوقائي لـ Omega-3 على السمية الكلوية المحرضة بالأميكاسين حيث أظهرت تأثير مضاد للأكسدة عن طريق تقليل إنتاج الأنواع الأوكسجينية التفاعلية ROS وهذا بدوره حسن وظيفة الكلى ومعدل الترشيح الكبيبي [8].

وتم إجراء دراسة للتحقق من فعالية Omega-3 للوقاية من السمية الكلوية الحادة التي يسببها الميتوتريكسات فساعدت في التخفيف من آثاره الضارة على الكلى من خلال دورها المضاد للأكسدة والمضاد للالتهاب والموت الخلوي المبرمج [9].

لـ Omega-3 تأثيرات وقائية في أعضاء أخرى كما في القلب حيث تؤدي إلى انخفاض خطر أمراض القلب التاجية واحتشاء عضلة القلب والوفيات القلبية الوعائية [10]، وفي الدماغ تلعب دوراً في تقليل خطر التدهور المعرفي ومرض الزهايمر[11].

الهدف من الدراسة:

تقييم فعالية Omega-3 في الوقاية من الأذية الكلوية المحدثة بأحد أدوية الـ NSAIDs عند جرذان التجربة.

 

المواد والطرائق Materials and Methods

مكان إجراء الدراسة:

أُجريت الدراسة في كلية الصيدلة بجامعة دمشق.

المواد والكواشف والأدوات:

تمَّ استخدام ديكلوفيناك الصوديوم (تم الحصول عليه من شركة حماة فارما كمادة أولية بشكل مسحوق جاهز للانحلال بدرجة نقاوة (99.90%، Omega-3 (دواء مصنّع بشكل كبسولات زيتية تمَّ الحصول عليها من شركة ADRIEN GAGNON)، دي ميتيل سلفوكسيد (DMSO)، كيتامين وكزيلازين، فورمول 10%، حمض التيوباربيتوري (TBA)، حمض الخل مثلث الكلور (TCA)، حمض كلور الماء (HCl)، الماء الأوكسجيني (H₂O₂)، حمض الكبريت (H₂SO₄)، برمنغنات البوتاسيوم (KMNO₄)، أنابيب تنبيب فموي، أنابيب جمع دم، أنابيب ابندروف، سيرنغات الانسولين،ٍ سيرنغات 3 مل، عبوات عقيمة لجمع العينات النسيجية، أنابيب اختبار زجاجية، ممص ميكروني، ميزان الكتروني، المثفلة الدوارة، مجمدة (-80°C)، جهاز المجانسة بالأمواج فوق الصوتية، جهاز سبيكتروفوتومتر.

إجراءات التجربة:

جرى العمل على 23 جرذاً مخبرياً من سلالة Albino Wistar جنس الذكور البيضاء البالغة، بوزن يتراوح مابين 213-131 غ،استُقدمت من حواضن حيوانات التجربة في الجامعة العربيّة الدوليّة AIU و وُضعت في حواضن حيوانات التجربة في كلية الصيدلة – جامعة دمشق، وذلك ضمن أقفاص تسمح بالوصول الحر للماء والغذاء، بحيث يحتوي القفص الواحد على 3 جرذان، ضمن غرفة جيدة التهوية والإضاءة معرضة لـ 12/12 ساعة من حلقة ضوء/ ظلام ودرجة حرارة (23±1 ℃)، وقد تُركت لمدة أسبوع للتأقلم مع البيئة الجديدة قبل البدء بالتجربة.

تم توزيع الجرذان عشوائياً في 4 مجموعات وكانت فترة التجربة أسبوعين كما يلي:

المجموعة الشاهدة الطبيعيّة Control group Natural: تضمنت 5 جرذان وتم إعطاؤها DMSO عن طريق الحقن العضلي من اليوم الخامس حتى اليوم السابع من التجربة أي أثناء فترة إعطاء الديكلوفيناك للمجموعات الأخرى.

المجموعة الشاهدة المرضيّة: تضمنت 6 جرذان وتمّ حقنها بدواء الـ Diclofenac المنحل بـ DMSO عن طريق الحقن العضلي بجرعة 50 mg/kg/day [12] لمدة 3 أيام من اليوم الخامس حتى اليوم السابع من التجربة [13] وقد تمَّ اختيار هذه الجرعة اعتماداً على دراسات سابقة أكدت أن إعطاء ديكلوفيناك الصوديوم للجرذان بالجرعة السابقة يسبب أذية كلوية واضحة [12]، [14].

المجموعة الوقائية أوميغا 400: تضمنت 6 جرذان، أُحدث لديها أذية كلوية كما في المجموعة المرضية حيث تم إعطاؤها أوميغا 3 بالتجريع الفموي بجرعة 400 mg/kg/day [15] منذ اليوم الأول حتى اليوم السابع [16] وحقنت بالديكلوفيناك بجرعة 50 mg/kg  بعد ساعة واحدة من إعطاء جرعة أوميغا الوقائية [12]، وذلك بدءاً من اليوم الخامس وحتى اليوم السابع [13].

المجموعة الوقائية أوميغا 600: تضمنت 6 جرذان، أُحدث لديها أذية كلوية كما في المجموعة المرضية حيث تم إعطاؤها أوميغا 3 بالتجريع الفموي بجرعة 600 mg/kg/day منذ اليوم الأول حتى اليوم السابع [16] وحقنت بالديكلوفيناك بجرعة 50 mg/kg بعد ساعة واحدة من إعطاء جرعة أوميغا الوقائية [12]، وذلك بدءاً من اليوم الخامس وحتى اليوم السابع [13]. وقد استند اختياري لهاتين الجرعتين إلى مبدأين: الأول هو اختبار فعالية الجرعات في نطاق علاجي مرتفع ولكنه آمن ومذكور في دراسات سابقة والثاني هو تقييم الفعالية الوقائية في فترة زمنية أقصر وتقييم ما إذا كان لـ Omega-3 تأثير وقائي سريع يمكن ملاحظته في أسبوع واحد.

جمع العينات الدموية:

تمّ تخدير الجرذان بعد 24 ساعة من انتهاء التجربة حيث تمّ التخدير باستخدام الكيتامين والكزيلازين (87.5 mg/kg ketamine,12.5 mg/kg xylazine i.p) حقن داخل البريتوان [17] ثمّ تم سحب الدم من القلب مباشرة [18]، وتم وضعه في أنابيب غير حاوية على مانع تخثر وتُركت 30 دقيقة لتتخثر وبعدها وُضعت في المثفلة (3000 دورة/دقيقة لمدة 15 دقيقة) للحصول على المصل بهدف إجراء المقايسات المصلية لليوريا والكرياتينين [19].

التضحية بالحيوانات:

تمّت التضحية بالجرذان بعد عملية سحب الدم مباشرةً من خلال تشريحهم عبر فتح البطن ثمّ تمّ استئصال الكليتين والقيام بفحصهم عيانياً، وُضعت الكلية اليمنى ضمن أنابيب ابندروف وحُفظت بالمجمدة (-80°C) لاستخدامها لاحقاً من أجل إجراء المقايسات الكيميائية الحيوية (MDA, CAT activity)، أما الكلية اليسرى فقُطِّعت طولياً وتمَّ تخزينها في الفورمول (10%) لإجراء الفحوصات النسيجية [19].

دراسة التغير في وزن الجسم Change in Body Weight Ratio:

سُجِّل وزن كل جرذ من الجرذان المدروسة يومياً خلال فترة التجربة ومن ثمَّ قمنا بدراسة الفرق بين وزن الجرذ في يوم التضحية ووزنه في بداية التجربة (اليوم الأول من التجربة).

المعالم المدروسة لتقييم درجة الأذية الكلوية:

• الفحص العياني:

بعد التشريح واسئصال الكليتين قمنا بالفحص العياني للكلى لدى جميع حيوانات التجربة.

• مقايسة مستويات الكرياتنين في المصل assay creatinine :Serum

تمت معايرة الكرياتينين باستخدام عتيدة الكرياتينين بالطريقة الحركية اللونية kinetic colorimetric method من شركة Linear Chemicals الإسبانية [20].

اعتمد مبدأ المعايرة على تفاعل Jaffe الذي يتفاعل فيه الكرياتينين في وسط قلوي pH>12 مع أيونات البيكرات مؤدياً إلى تشكل معقد أحمر، والذي يتناسب معدل تشكله (المقاس من خلال زيادة الامتصاصية في فترة زمنية محددة مسبقاً) مع تركيز الكرياتينين في العينة.

وهذه العتيدة تتكون من:

• الكاشف R1 هو حمض البيكريك (25mM/L).
• الكاشف R2 يحتوي على وقاء الفوسفات ( 300 mM/L،pH=12.7 ) ، ومادة Sodium dodecyl sulfate (2 g/L).
• محلول عياري من الكرياتينين (2mg/dl).

في البداية تمَّ تحضير كاشف العمل وهو عبارة عن حجم واحد من R1 مع حجم واحد من R2 ومن ثم وُضعت جميع المواد في حرارة (℃ (37 والتي تم العمل عليها طوال الوقت، قمنا باستخدام محفدين أحدهما للعينة والآخر للعياري وقبل البدء تمّ ضبط جهاز UV-Vis على الصفر باستخدام الماء المقطر، وُضع في المحفد ((1ml من كاشف العمل وأُضيف لها (100µl) من العينة أو العياري ومُزجت المكونات بلطف ووُضعت في الجهاز المضبوط الحرارة ومن ثمَّ تمت قراءة الامتصاص عند طول موجة (510 nm) لكل من العينة والعياري حيث أن [الامتصاصية الأولى (A1) والامتصاصية الثانية (A2)] تمّت القراءتين في اللحظة (0) بعد 90 ثانية.

واستُخدم القانون التالي لحساب تركيز الكرياتينين لكل عينة:

حيث أن A: الامتصاصية، C: التركيز

• مقايسة اليوريا في المصل Serum urea assay:

تمّ استخدام عتيدة تحليل اليوريا بالطريقة الإنزيمية اللونية enzymatic colorimetric method  من شركة Linear Chemical الإسبانية [21]. تمّ القياس باتباع إرشادات المصنّع وكذلك وفقاً للمرجع [22].

بدءاً من اليوم الخامس وحتى اليوم السابع [13]. وقد استند اختياري لهاتين الجرعتين إلى مبدأين: الأول هو اختبار فعالية الجرعات في نطاق علاجي مرتفع ولكنه آمن ومذكور في دراسات سابقة والثاني هو تقييم الفعالية الوقائية في فترة زمنية أقصر وتقييم ما إذا كان لـ Omega-3 تأثير وقائي سريع يمكن ملاحظته في أسبوع واحد.

جمع العينات الدموية:

تمّ تخدير الجرذان بعد 24 ساعة من انتهاء التجربة حيث تمّ التخدير باستخدام الكيتامين والكزيلازين (87.5 mg/kg ketamine,12.5 mg/kg xylazine i.p) حقن داخل البريتوان [17] ثمّ تم سحب الدم من القلب مباشرة [18]، وتم وضعه في أنابيب غير حاوية على مانع تخثر وتُركت 30 دقيقة لتتخثر وبعدها وُضعت في المثفلة (3000 دورة/دقيقة لمدة 15 دقيقة) للحصول على المصل بهدف إجراء المقايسات المصلية لليوريا والكرياتينين [19].

التضحية بالحيوانات:

تمّت التضحية بالجرذان بعد عملية سحب الدم مباشرةً من خلال تشريحهم عبر فتح البطن ثمّ تمّ استئصال الكليتين والقيام بفحصهم عيانياً، وُضعت الكلية اليمنى ضمن أنابيب ابندروف وحُفظت بالمجمدة (-80°C) لاستخدامها لاحقاً من أجل إجراء المقايسات الكيميائية الحيوية (MDA, CAT activity)، أما الكلية اليسرى فقُطِّعت طولياً وتمَّ تخزينها في الفورمول (10%) لإجراء الفحوصات النسيجية [19].

دراسة التغير في وزن الجسم Change in Body Weight Ratio:

سُجِّل وزن كل جرذ من الجرذان المدروسة يومياً خلال فترة التجربة ومن ثمَّ قمنا بدراسة الفرق بين وزن الجرذ في يوم التضحية ووزنه في بداية التجربة (اليوم الأول من التجربة).

المعالم المدروسة لتقييم درجة الأذية الكلوية:

• الفحص العياني:

بعد التشريح واسئصال الكليتين قمنا بالفحص العياني للكلى لدى جميع حيوانات التجربة.

• مقايسة مستويات الكرياتنين في المصل Serum creatinine assay:

اعتمد مبدأ المعايرة على حلمهة اليوريا بواسطة إنزيم اليورياز إلى أمونيا NH₃ و CO₂، ومن ثم تفاعل الأمونيا الناتجة مع هيبوكلوريت الصوديوم وساليسيلات الصوديوم بوجود نتروبروسيد الصوديوم كمحفز لتشكيل صباغ أخضر تتناسب شدة لونه مع تركيز اليوريا في العينة.

العتيدة تتكون من:

• الكاشف الأول (R1) Reagent 1 الذي يحتوي على إنزيم اليورياز.
• الكاشف الثاني (R2) يحتوي على وقاء فوسفات (pH=6.9، 20 mM/L)، (EDTA) Ethylenediaminetetraacetic acid (2 mM/L)، ساليسيلات الصوديوم (60 mM/L)، ونتروبروسيد الصوديوم (4 mM/L).
• الكاشف الثالث (R3) ويحتوي على هيبوكلوريت الصوديوم (10 mM/L) بالإضافة إلى هيدروكسيد الصوديوم (150 mM/L).
• محلول عياري من اليوريا (50 mg/dl=8.3 mM/L).

تمّ تحضير كاشف العمل بمزج حجم واحد من R1 مع 24 حجماً من R2، وتُركت الكواشف والعينات في درجة حرارة الغرفة. استُخدمت ثلاثة محافد:  (1cm)المحفد الأول هو الناصع Blank ووضع فيه ((1 ml من كاشف العمل، المحفد الثاني وُضع فيه ((1 ml من كاشف العمل بالإضافة إلى ((10 µl من العينة المصليّة، أما المحفد الثالث فقد وُضع فيه ((1 ml من كاشف العمل بالإضافة إلى (10 µl) من محلول اليوريا العياري، وفيما بعد مُزجت هذه المواد وحُضنت لمدة 5 دقائق عند الدرجة (37 ℃) ومن ثمّ 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 ℃) وبعد ذلك أُضيف ((1 ml من R3 إلى المحافد الثلاثة وحُضنت كما في خطوة الحضن السابقة.

تمت قراءة الامتصاصية عند طول الموجة (600 nm) لكل من العينات والعياري مقابل الناصع باستخدام جهازUV-Vis Spectrophotometer  وقياس تركيز اليوريا بالقانون التالي:

حيث A: االامتصاصية، C: التركيز.

• مقايسة مستويات MDA)) Malondialdehyde assay في نسيج الكلية:

تسبب الجذور الحرة الزائدة أضراراً تأكسدية للجزيئات الخلوية المختلفة بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية في الأنسجة المختلفة. تنتج مادة MDA عن تحلل الدهون المتعددة غير المشبعة ويستخدم إنتاج هذه المادة كمؤشر حيوي لقياس مستوى الأكسدة الفائقة اللبيدية Lipid peroxidation.  يتفاعل MDA مع  حمض التيوباربيتوريك (TBA) بنسبة (1:2) كمواد تفاعلية لحمض التيوباربيتوريك thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) ليشكل معقد ((MDA-TPA يقاس امتصاصه عند طول الموجة (532 nm)، وبالتالي فإن كمية (TBARS) تتناسب مع كمية MDA [23]. قمنا بتحضير محلول الكاشف الذي يحتوي على حمض الخل ثلاثي الكلور (15%w/v)، حمض الثيوباربيتوريك TBA (0.375% w/v)، وحمض كلور الماء Hcl (0.25N)، ومن ثمَّ تسخين المحلول بشكل طفيف لتسهيل انحلال TPA [24]. تمّ أحذ (0.5 ml) من الجناسة وتمت إضافتها إلى أنبوب اختبار يحوي (2 ml) من الكاشف السابق وتمّ تسخين المزيج في حمام مائي يغلي لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك تمَّ تبريده وتثفيله بقوة (1000 g) لمدة 10 دقائق.

في الخطوة التي تليها تمَّ سحب الحجم المحدد من العينة عبر الممص الميكروني وتمَّ وضعه في محفد (1 cm) من أجل قياس امتصاص العينات عبر جهاز Spectrophotometer عند طول الموجة (532 nm) مقابل الناصع الذي يحوي جميع الكواشف باستثناء الليبيدات، ومن ثمَّ تمّ حساب تركيز TBARS بواحدة µM في 100 g من النسيج (µM/100 g من النسيج) باستعمال معامل الامتصاص المولاري Molar extinction coefficient (1.56 × 10^{^5} M^-1 cm^-1 ) حسب القانون التالي [25] [26]:

حيث: A: الامتصاصية، 10⁸: ناتجة عن 10⁶ (تحويل M إلى µM ) × 10²  (ضرب البسط والمقام بـ 10² للتعبير عن الواحدة في 100 g من النسيج)

• مقايسة فعالية الكاتالاز Catalase activity assay في النسيج: [24]

يمنع الكاتالاز تجمع H₂O₂ عبر تحويله إلى H₂O و O₂.

H₂O₂    —>       2H₂O + O₂

خطوات المقايسة:

تُثفل الجناسة في المثفلة الباردة بدرجة حرارة 4 ℃ وبسرعة 3600 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

بعد التثفيل يُؤخذ 0.5 مل من السائل الطافي إلى أنبوب حاوي على 5 ml من الماء الأوكسجيني بتركيز  30 mM ونقوم بالتحريك لضمان مزج المكونات.

تمّ إيقاف التفاعل بعد 3 دقائق بإضافة 1 ml حمض الكبريت  6 M، تلاها إضافة 7 ml برمنغنات البوتاسيوم 0.01 M وقراءة الامتصاصية عند طول موجة 480 nm خلال 30-60 ثانية.

تُحسب فعالية الكاتالاز عبر المعادلة التالية بواحدة (unit/ml):

: معامل الامتصاص المولاري ويساوي 40، V: حجم المزيج التفاعلي، v: حجم العينة المستخدم، Y: وزن النسيج.

• فحص معالم التشريح المرضي :Histopathological examination

جرت دراسة العينات تحت المجهر الضوئي من قبل أخصائي التشريح المرضي في المشفى الوطني الجامعي حيث فُحصت 10 ساحات مجهرية على الأقل وسُجلت النتائج.

تمَّ تقييم الأذية النبيبية من حيث التوسع Dilatation والتفجي Vacuolation والتنخر Necrosis وفقدان حدود الفرشاة Brush Border Loss كما قُيِّم وجود الاحتقان والتوسع الوعائي Vasodilation and Congestion وارتشاح الخلايا الالتهابية Inflammatory cell infiltration على النّحو التّالي: 0: لا يوجد، 1: خفيف، 2: متوسّط، 3: شديد [14],[27].

الدراسة الإحصائية Statistical analysis:

استُخدِمَ المتوسّط ± الخطأ المعياري للمتوسّط Mean ± S.E.M للتعبير عن النتائج، وتمّ اعتبار أنّ الفارق الإحصائي بين المتوسطات معتدّاً به عندما تكون قيمة p-value أقل من 0.05 (p< 0.05)، حيث أجُرِيَتْ الدراسة الإحصائيّة باستخدام برنامج SPSS version 26 for windows، واختيار One-Way ANOVA متبوعاً باختبار post Hoc Dunnett T3 للنتائج المعلمية parametric التي لها تباينات مختلفة non-equal variances، واختبار Sidak للنتائج المعلمية التي لها تباينات متساوية equal variances، واستخدام اختبار Kruskal-Wallis H متبوعاً باختبار Dunn للنتائج اللامعلمية non-parametric.

النتائج Results

الفحص العياني:

بدت الكلى في المجموعة الشاهدة الطبيعية بمظهر وحجم طبيعيين، أما الكلى في المجموعة المرضية فقد ظهرت بحجم أكبر قليلاً مع وجود شحوب في لون القشرة، وبالنسبة لمجموعتي الوقاية Omega 400 و Omega 600 فقد ظهرت الكلى بشكل مشابه تقريباً للمجموعة المرضية.

الشكل (1): صور عيانية للكلية لدى مجموعات الدراسة.

A: المجموعة الشاهدة، B: المجموعة المرضية، C: المجموعة الوقائية Omega 400،

D: المجموعة الوقائية Omega 600.

الفروقات بين أوزان الجرذان في يوم التضحية وبداية التجربة:

أظهرت النتائج أن إعطاء Diclofenac قد أدى إلى حدوث نقصان في الوزن لدى المجموعة المرضية (Dic) (-12±2.76) بفارق هام إحصائياً (0.01>p) بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة (Control) (12.60± 0.81).

ولم يكن هناك فارق إحصائي بين كلٍ من مجموعة Omega 400 (-15±1.46) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (-12±2.76) ومجموعة Omega 600 (14±1.58-) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (-12±2.76). وكذلك الأمر بين مجموعتي Omega 400 و Omega 600.

الشكل (2): الفرق بين أوزان الجرذان بين اليوم الأخير واليوم الأول لمجموعات الدراسة

P<0.01 Dic vs Control **  ,(n=5-6)

مستويات الكرياتينين في المصل:

أظهرت نتائج الاختبار أن إعطاء Diclofenac قد سبب ارتفاعاً واضحاً بفارق إحصائي هام جداً (0.001>p) في مستويات الكرياتينين في المصل لدى المجموعة المرضية (Dic) (1.015±0.043) بالمقارنة مع المجموهة الشاهدة (Con) (0.512±0.039).

أما في مجموعة Omega 3  فقد لوحظ انخفاض مستويات الكرياتينين في المصل بفارق إحصائي (0.05>p) عند إعطاء (Omega3 400) (0.807±0.038) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (1.015±0.043) كما لوحظ وجود فارق إحصائي (0.05>p) عند إعطاء600)  (Omega3 (0.800±0.013) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (1.015±0.043). لم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega 400 و Omega 600.

نتائج مقايسة اليوريا في المصل Serum Urea asaay:

أظهرت نتائج الاختبار أن إعطاء Diclofenac قد سبب ارتفاعاً واضحاً بفارق إحصائي هام جداً (0.001>p) في مستويات اليوريا في المصل لدى المجموعة المرضية (Dic) (82.67±3.07) بالمقارنة مع المجموهة الشاهدة (Con) (34.40±1.327).

أما في مجموعة Omega فقد لوحظ انخفاض مستويات اليوريا المصلية بفارق إحصائي (0.05>p) عند إعطاء (Omega3 400) (53.33±5.73) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (82.67±3.07)، كما لوحظ وجود فارق هام إحصائياً (0.01>p) عند إعطاء600)  (Omega3      (57.67±2.06) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (82.67±3.07). كما لم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega 400 و Omega 600.

نتائج مقايسة مستويات MDA في نسيج الكلية:

أظهرت نتائج الاختبار أن إعطاء Diclofenac قد سبب انخفاضاً واضحاً بفارق إحصائي هام جداً(0.001>p) في فعالية MDA في النسيج الكلوي لدى المجموعة المرضية (Dic) (90.667±3.252) بالمقارنة مع المجموهة الشاهدة (Con) (41.800±2.956).

أما في مجموعة Omega 3  فقد لوحظ انخفاض مستويات MDA بفارق هام إحصائياً (0.01>p) عند إعطاء (Omega3 400) (64.883±3.919) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (90.667±3.252) كما لوحظ وجود فارق هام إحصائياً (0.01>p) عند إعطاء600)  (Omega3 (63.333±6.173) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (90.667±3.252). كما لم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega 400 و Omega 600.

نتائج مقايسة فعالية  CATفي نسيج الكلية:

أظهرت نتائج الاختبار أن إعطاء Diclofenac قد سبب انخفاضاً واضحاً بفارق إحصائي هام (0.01>p) في فعالية إنزيم CAT في النسيج الكلوي لدى المجموعة المرضية (Dic) (4.543±0.245) بالمقارنة مع المجموهة الشاهدة (Con) (6.198±0.218).

أما في مجموعة Omega 3  فقد لوحظ ارتفاع مستويات الكاتالاز بفارق إحصائي (0.05>p) عند إعطاء (Omega3 400) (5.580±0.233) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (4.543±0.245) كما لوحظ وجود فارق إحصائي (0.05>p) عند إعطاء600)  (Omega3 (5.700±0.296) بالمقارنة مع المجموعة المرضية (Dic) (4.543±0.245). كما لم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega 400 و Omega 600.

نتائج الفحص النسيجي:

لقد أظهرت نتائج الفحص النسيجي المجهري أن دواء Diclofenac قد سبب ارتفاع واضح بفارق هام إحصائياً (0.01>p) في درجة الأذية للتوسع النبيبي والتنخر النبيبي والتوسع والاحتقان الوعائي وارتشاح الخلايا الالتهابية بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة وارتفاع بفارق إحصائي هام جداً (0.001>p)  بالنسبة للتفجي النبيبي بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة.

بينما أدى إعطاء Omega 3 بجرعتين 400 mg و 600 mg إلى تحسن هذا المعالم لدى المجموعات الوقائية ولكن دون وجود فارق إحصائي بالمقارنة مع المجموعة المرضية، كما لم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega-3.

كما أظهرت نتائج الفحص النسيجي المجهري أن دواء Diclofenac قد سبب ارتفاع واضح بفارق إحصائي (0.05>p) في فقدان الحدود الخلوية الفرشاتية بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة.

بينما أدى إعطاء Omega-3 بجرعتي 400 mg و 600 mg إلى تحسن هذا المعلم لدى المجموعات الوقائية ولكن دون وجود دلالة إحصائية بالمقارنة مع المجموعة المرضية، ولم يكن هناك فارق إحصائي بين مجموعتي Omega-3.

المناقشة Discussion

تعد الأذية الكلوية الحادة مشكلة صحية منتشرة بشكل متزايد في العالم، وتتسبب بحدوث الوفيات والمراضات morbidity بنسبة كبيرة، ويعد التعرض لبعض الأدوية مسبباً أساسياً لتحريض السمية الكلوية [28]. تعرف مضادات الالتهاب اللاستيروئيدية NSAIDs بأنها من أكثر الأدوية الموصوفة عالمياً بسبب فعاليتها القوية في تسكين الألم المحيطي وتخفيف الالتهاب وخفض الحرارة الناجمة عن حالات مرضية عديدة فضلاَ عن كونها متاحة دون وصفة طبية [29]. تتجلى آليات NSAIDs في إحداث السمية الكلوية بـ 3 سبل رئيسية هي: اختلال التروية الكلوية وسبيل الالتهاب وسبيل الجذور الأكسجينية الحرة [30]. يعد الديكلوفيناك عضواً فريداً في عائلة NSAIDs بسبب تنوع آليات عمله [31]. لذا جَلَبَت استخداماته السريرية الواسعة توجهاً جدياً نحو دراسة سميته في الأنسجة الحيوية والتي من ضمنها النسيج الكلوي [32].

ركزت العديد من الدراسات على حيوانات التجربة على أهمية استعمال المركبات التي تمتلك خصائص مضادة للأكسدة كإجراء وقائي ضد السمية الكلوية الناجمة عن تطبيق Diclofenac وقد أبدى العديد منها فعالية وقائية [33],[34].

تمّ في الدراسة الحالية تقصي التأثيرات الوقائية لدواء Omega 3 على السمية الكلوية المحدثة بالديكلوفيناك لدى جرذان التجربة، حيث تم تحديد الفروقات بين الأوزان في يوم التضحية وبداية التجريع، ومستويات اليوريا والكرياتينين في المصل كمؤشر على الوظيفة الكلوية، ومعايرة معالم الشدة التأكسدية لمستويات MDA وفعالية إنزيم CAT في النسيج الكلوي، بالإضافة إلى إجراء الفحص العياني والنسيجي للكلية.

أظهرت هذه الدراسة أن حقن الديكلوفيناك (i.m) بجرعة 50 mg/kg لمدة 3 أيام أدى إلى تغيرات مورفولوجية في كلى الجرذان من حيث الشكل واللون، إذ بدت القشرة الكلوية شاحبة اللون عيانياً وجرى توثيق ذات الملاحظة في دراسة Owumi وزملائه [35].

كما أدى Diclofenac إلى انخفاض في أوزان الجرذان بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة وقد اتفقت دراستنا مع دراسة Yasmeen وزملائها عام 2007 ودراسة Alabi وزملائه عام 2018 وقد يعود ذلك إلى المضاعفات الهضمية التي يحدثها الديكلوفيناك كفقدان الشهية للطعام حيث لوحظ تراجع في قبط الطعام والذي يمكن أن يسبب هذا الفقدان في الوزن. كما لوحظ حالات إسهال وطراوة في البراز لدى الحيوانات حيث اتفقت هذه الدراسة مع دراسة Alabi وزملائه عام 2020 التي بينت أن سبب فقدان الوزن هو حدوث الإسهال بوصفه عرضاَ جانبياً للديكلوفيناك [36–38].

لقد أظهرت الاختبارات الكيميائية الحيوية التي تهدف إلى تقصي تأثير Diclofenac على الوظيفة الكلوية ارتفاعاً واضحاً في مستويات الكرياتينين واليوريا في المصل بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة وهذا يشير إلى حدوث تراجع في الوظيفة الكلوية. توافقت هذه النتيجة مع العديد من الدراسات التي أكّدت حدوث هذه الزيادة عند إعطاء Diclofenac [33,34,39,40]. يمكن أن يُعزى هذا الارتفاع في المستويات المصلية للكرياتينين والبولة إلى أن ديكلوفيناك يثبط اصطناع البروستاغلاندينات المسؤولة عن تنظيم تدفق الدم الكلوي والترشيح الكبيبي مما يؤدي إلى اختلال وظائف الكلى[46] ،[47]. كما درسنا تأثير Diclofenac على الشدة التأكسدية إذ عمل على زيادة مستويات نواتج أكسدة الشحوم في النسيج الكلوي MDA بفارق إحصائي هام جداً كما خفض فعالية إنزيم CAT لدى المجموعة المرضية كدليل واضح على أن Diclofenac يزيد من الشدة التأكسدية، وهذا يتوافق مع نتائج الدراسات التي أظهرت أن ديكلوفيناك يقلل من نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة متل CAT و SOD التي تؤدي دوراً أساسياً في الجسم ضد الشدة التأكسدية إذ يقوم SOD  بالتخلص من أنيونات فوق الأكاسيد superoxide anion ويقوم الكاتالاز بتحويل H₂O₂ إلى أكسجين و ماء لحماية الخلايا            ضد hydrogen peroxide [41]. تعمل الإنزيمات المضادة للأكسدة مثل CAT و SOD على تعطيل أنيونات فوق الأكاسيد وجذور البيروكسيد عن طريق تحويلها إلى ماء وأوكسجين حيث يؤدي هذان الإنزيمان خطاً دفاعياً مهماً ضد الشدة التأكسدية وقد يعزى تراجع فعالية الإنزيمات المضادة للأكسدة بأنها قد استُنفِذَت من قبل الديكلوفيناك ومستقلباته السامة للكلية [42].

لم تُظهر المجموعتين الوقائيتين المعالجتين بـ Omega-3 تحسناً في المظاهر العيانية للكلية، كما أنها لم تُظهر أي تغير في الوزن بين يوم التضحية واليوم الأول بالمقارنة مع المجموعة المرضية وانسجم ذلك مع دراسة Milanovic وزملائه [43] وقد يعزى ذلك إلى أن التأثير الخافض للشحوم لـ Omega-3 يرتبط بتعديل مستويات الكزوليسترول والشحوم الثلاثية في الدم ولا يؤثر بشكل مباشر على الشهية ومعدل الاستقلاب بما يكفي لإحداث تغير في الوزن الكلي للجسم [44].

تحسنت الوظيفة الكلوية بانخفاض مستويات الكرياتينين والبولة في الدم لدى المجموعتين أوميغا 400 و أوميغا 600 بالمقارنة مع المجموعة المرضية وقد توافقت نتائج هذه الدراسة مع نتائج الدراسات [45], [46]، حيث تقلل Omega-3 من ارتفاع الشحوم في الدم وتخفض مستويات الكوليسترول الكلي وبالتالي الحد من التصلب الكبيبي وتحسن وظيفة الكلى [46]. كما تؤدي Omega-3 إلى زيادة توافر أكسيد النتريك Nitric Oxide NO)) داخل الأوعية عبر تنشيط Endotheliale Nitric Oxide Synthase (eNOS) مما يحسن وظيفة البطانة الوعائية والدورة الدموية داخل الكلية وهذا يؤدي إلى انخفاض المقاومة الوعائية وتحسين معدل الترشيح الكبيبي [47], [48]. كما أدى إعطاء Omega-3 إلى انخفاض الإجهاد التأكسدي وانخفاض مستويات نواتج أكسدة الشحوم  MDAفي نسيج الكلية في مجموعتي Omega 3 بالمقارنة مع المجموعة المرضية وقد اتفق ذلك مع دراسة Abdullah وزملائه التي أُجريت على نموذج للسمية الكلوية المحرضة بـ CCI4 لدى الجرذان ودراسة Mohammed وزملائه التي أُجريت على نموذج للسمية الكلوية المحدثة بالميثوتركسات لدى الجرذان [46]، [49]. وقد يفسر قدرة أوميغا 3 على خفض مستويات MDA بما يلي حيث تعد فوق أكسدة الدهون LPO) Lipid Peroxidation) سلسلة تفاعلات تتوسطها الجذور الحرة والتي غالباً ماتؤدي إلى أكسدة الدهون المتعددة غير المشبعة ومن المعروف أن MDA من النواتج النهائية لفوق أكسدة الدهون وترتبط قدرة أوميغا 3 على خفض مستوى LPO بقدرتها على توفير الالكترونات الحرة من مركزها الغني بالالكترونات مما يمنع نزع الجذور الحرة للالكترونات من الدهون الغشائية الغنية بالالكترونات وبالتالي الحفاظ على سلامة غشاء الخلية وتوازنها الداخلي. كما ارتفعت مستويات CAT لدى مجموعتي أوميغا 3 بالمقارنة مع المجموعة المرضية واتفق ذلك مع دراسة Khan وزملائه التي أُجريت على نموذج للسمية الكلوية المحدثة بنتريت الصوديوم لدى كلى الجرذان [50].

أظهر الفحص النسيجي للمجموعة المرضية المعالجة بالـDiclofenac  وجود أذيات نبيبية تظاهرت بتوسع وتفجي نبيبي لدى المجموعة المرضية وهذا يتفق مع نتائج الدراسات [14]، [36]، [51]. ويعزى ظهور الفجوات الخلوية في الأنابيب إلى الإجهاد الخلوي والتلف الناتج عن زيادة نفاذية غشاء الخلية مما يؤدي إلى تراكم الماء ونتيجة لذلك ترتفع الأسمولية داخل الخلايا الكلوية مما يتسبب في تمدد الأنابيب [52]. وفسرت مراجع أخرى زيادة قطر الأنابيب القريبة إلى انحلال الخلايا في الأنابيب القريبة مما أدى إلى زيادة واضحة في قطرها [36].

كما تظاهرت الأذية النبيبية أيضاً بحدوث تنخر نبيبي لدى المجموعة المرضية المعالجة بالـ Diclofenac وقد توافق هذا مع نتائج الدراسات [38] [53] [14] وقد يفسر تنخر النبيبات بانخفاض التروية الكلوية وتثبيط اصطناع البروستاغلاندينات في النسيج الكلوي وخاصة PGE2 مما يؤدي لتضيق الشرينات الكلوية [54] وتظاهرت النتيجة السابقة مع فقدان حدود الفرشاة وهذه النتيجة تتفق مع نتائج دراسة Shakibaie وزملائه [51].

كما أظهر الفحص النسيجي للمجموعة المرضية وجود ارتشاح للخلايا الالتهابية وهذا يتوافق مع نتائج العديد من الدراسات [37]، [39]، [40] حيث يحرض الديكلوفيناك على زيادة مستويات السيتوكينات الالتهابية في النسيج الكلوي للجرذان كالـ IL-2 و α-TNF وبالتالي يؤدي إلى حدوث الالتهاب الكلوي والشدة التأكسدية [55].  كما يحرض الديكلوفيناك على التكثف النووي وتشدف الدنا في النسيج الكلوي سواءً كان ذلك في المختبر أم في العضوية الحية [51]، وتدعم دراسة Hashem وزملائه هذه الفرضية بسبب توصلهم إلى نتيجة مفادها أن إعطاء الديكلوفيناك قد أنقص من عيوشية المتقدرات وزاد النسبة المئوية لتشدف الدنا [56]. كما أكدت دراسة  Hashem وزملائه زيادة التعبير عن الرنا المرسال الخاص بـ NF-κB لدى حيوانات المجموعة المرضية التي عولجت بالديكلوفيناك [56].

يوجد NF-κB عادة في الهيولى مرتبطة بالبروتين المثبط له IκBα، تقوم السيتوكينات بتفعيلIκB kinase  الذي يفسفر البروتين المثبط IκBα ويعطله، وبالنتيجة تغير NF-κBموضعها وتدخل إلى النواة لترتبط بالدنا وهذا يعزز التعبير عن مجموعة من الجينات التي من ضمنها جينات السيتوكينات الالتهابية [56].

لوحظ وجود احتقان وتوسع وعائي في الأوعية الدموية في المجموعة المرضية وقد دعم ذلك نتائج دراسة Mustafa وزملائه [54]، قد يعزى ذلك إلى تثبيط إنزيمي COX-1 و COX-2 مما يؤدي إلى نقص تصنيع البروستاغلاندينات الكلوية وهذا يخل بآلية التنظيم الذاتي لتدفق الدم الكلوي ويسبب نقص  تروية في بعض المناطق مع ركود دموي في الأوعية كما قد يعزى إلى الإجهاد التأكسدي وإصابة الخلايا البطانية التي يسببها الدواء حيث يؤدي تلف البطانة وزيادة نفاذية الأوعية إلى تجمع الدم وحدوث الاحتقان [57].

نسيجياً لم يبد Omega-3 تحسناً في المعالم النسيجية واختلف ذلك مع دراسة El-Agawy وزملائه التي لاحظت تحسن التوسع النبيبي وانخفاض الرشاحة الالتهابية عند إعطاء Omega-3         150 mg/kg و 300 mg/kg لمدة أسبوعين للتخفيف من موت الخلايا النبيبية التي يسببها الميثوتركسات [9] ودراسة Malik وزملائه التي لاحظت تخفيف الاحتقان الوعائي والرشاحة الالتهابية عند إعطاء Omega-3 400 mg/kg لمدة 6 أسابيع للوقاية من الأذية الكلوية المحرضة بالدوكسوروبوسين  [15]، ودراسة Elsafty وزملائه التي أشارت إلى تراجع التنخر النبيبي وفقدان حدود الفرشاة عند إعطاء  Omega-3 100 mg/kg لمدة شهر في نموذج للأذية الكلوية المحرضة بالأسيتامينوفين [58].

قد يعزى اختلاف النتائج عن الدراسات المذكورة سابقاً إلى اختلاف مدة الإعطاء أو اختلاف الجرعات أو اختلاف الآلية التحريضية للمرض أو سلالة الحيوان المستخدم .

 

الاستنتاجات Conclusions

يُعد الديكلوفيناك خياراً أولياً وهاماً لتسكين الألم خاصةً لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتيد والفصال العظمي، لكنَ سميته الكلوية والهضمية تشكل عائقاً أمام استخدامه. قد اتجهت الدراسات لإيجاد علاجات وقائية لحماية الكلية من آثاره الضائرة. وُجد في هذه الدراسة أن الديكلوفيناك بجرعة 50 ملغ/كغ أدى إلى إحداث أذية كلوية ملحوظة على مستوى النبيبات وأوعية الكلية، ترافق هذا مع تدهور واضح في الوظيفة الكلوية وذلك بارتفاع مستويات البولة والكرياتينين المصلي وارتفاع مستويات MDA وفعالية CAT في نسيج الكلية، وكان لـ Omega 3 بجرعتي 400 ملغ/كغ و 600 ملغ/كغ دوراً واقياً على مستوى معالم الشدة التأكسدية المدروسة، ورافق ذلك تحسن في الوظيفة الكلوية.

لم يبد Omega 3 تحسناً عيانياً ونسيجياً للكلية وكذلك الأمر في معلم وزن الجسم.

الخلاصة Summary

تمَّ التوصل في هذه الدراسة إلى عدم قدرة Omega-3 بالجرعة والمدة المستخدمتين من تحسين المعالم النسيجية.

 

الموافقة الأخلاقية Ethics approval and consent to participate

حصلت هذه الدراسة على موافقة مجلس أخلاقيات الأبحاث الطبية الحيوية في جامعة دمشق بتاريخ 2024/7/14 برقم PH-140724-265.

 

تضارب المصالح Conflict of interests

يقر المؤلفون بعدم وجود مصالح متضاربة.

 

التمويل Funding

تلقى المؤلفون تمويلاً جزئياً منجامعة دمشق لأجل البحث.

 

مساهمات المؤلفين  Authors’ contributions

ابتسام عمران العمر البرازي: الباحث الأساسي، إجراء التجربة العملية وجمع عينات الدم للقيام بالاختبارات اللازمة وإجراء الدراسسة النسيجية والقيام بالدراسة الإحصائية وكتابة الجزء العملي والنظري للرسالة وللمقالة.

عبدالناصر عمرين: المشرف الأساسي في البحث من تصميم مخطط البحث والإشراف على جميع مراحل البحث.

المراجع :

1- Luciano. Randy PM. NSAIDs : Acute kidney injury. Uptodate. 2024. pp:1–22.
2- Klomjit N, Ungprasert P. European Journal of Internal Medicine Acute kidney injury associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs. Eur J Intern Med. 2022. vol:101. iss:April. pp:21–28.
3- S. Bindu, S. Mazumder UB. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and organ damage: A current perspective. Biochem Pharmacol. 2020. pp:1–21.
4- Bussmann AJC, Zaninelli TH, Saraiva-santos T, Fattori V, Guazelli CFS, Bertozzi MM, et al. The Flavonoid Hesperidin Methyl Chalcone Targets Cytokines and Oxidative Stress to Reduce Diclofenac- Induced Acute Renal Injury : Contribution of the Nrf2 Redox-Sensitive Pathway. MDPI. 2022. vol:11. iss:1261. pp:1–18.
5- Ng LE, Vincent AS, Halliwell B, Wong KP. Action of diclofenac on kidney mitochondria and cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006. vol:348. pp:494–500.
6- Basist P, Khan MU, Jan B, Khan MA, Parveen R, Ahmad S. Metabolite Profiling and Nephroprotective Potential of the Zea mays L . Silk Extract against Diclofenac-Induced Nephrotoxicity in Wistar Rats. ACS OMEGA. 2022. p. 36519–36534.
7- Famurewa AC, Akunna GG, Nwafor J, Chukwu OC, Ekeleme-egedigwe CA, Oluniran JN. Nephroprotective activity of virgin coconut oil on diclofenac-induced oxidative nephrotoxicity is associated with antioxidant and anti- inflammatory effects in rats. Avicenna J Phytomedicine. 2020. vol:10. iss:3. pp:316–324.
8- Thiab A, Hadeel H, Faraj R, Abdulredha WS. The Protective Effect of Omega3 Against Amikacin- Induced Nephrotoxicity in Rats. 110 Syst Rev Pharmacy,University Thi-Qar, Iraq. 2020. vol:11. iss:9. pp:110–117.
9- El-agawy MSE, Mohamed A, Badawy M, Rabei MR, Mahmoud M, Elshaer A, et al. Methotrexate-Induced Alteration of Renal Aquaporins Aquaporins 1 and 2 , Oxidative Stress and Tubular Apoptosis Can Be Attenuated by Omega-3 Fatty Acids Supplementation. Int J Mol Sci. 2022. vol:23. iss:12794. pp:1–19.
10- Djuricic I, Calder PC. Pros and Cons of Long-Chain Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids in Cardiovascular Health. Annu Rev ofPharmacology Toxicol. 2023. vol:63. pp:383–406.
11- Wei, B., Z., Li., L., Dong., C., W. et al. The Relationship of Omega-3 Fatty Acids with Dementia and Cognitive Decline: Evidence from Prospective Cohort Studies of Supplementation, Dietary Intake, and Blood Marker. Am J Clin Nutr. 2023. vol:117. pp:1096–1109.
12- El-shafei RA, Saleh RM. ScienceDirect Pharmacological effects of Vitamin C & E on Diclofenac Sodium intoxicated Rats. Biomed Pharmacother. 2016. vol:84. pp:314–322.
13- Eltahir HM, Aljuhani N, Alsubhi SA, Alahmadi GM, Elbadawy HM, Abouzied MM. Role of Ajwa dates in ameliorating diclofenac sodium-induced nephrotoxicity and cardiovascular risk factors in mice. Eur J Inflamm Vol. 2019. vol:7. pp:1–7.
14- Albassit S, Laham S Al, Al-manadili A. Histological Assessment of Selenium Protective Effect Against Diclofenac Sodium-Induced Nephrotoxicity in Rats. J Pharm Nutr Sci. 2023. pp:1–12.
15- Malik AS, Hatem SF, Abdul B, Mshemish R. Protective Effects of Omega-3 Supplement Against Doxorubicin-Induced Renal Injury in Male Rats : Histopathological Study. Pharm Sci. 2025. vol:25. iss:3.
16- Marcel AG, Sitapha O, Nazaire DB, Gnonseka L, Mederic C, Felix YH, et al. Evaluation of the Nephroprotective Effect of Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids on Gentamicin-Induced Renal Toxicity in Albino Wistar Rats. Am J Biosci. 2022. vol:10. iss:6. pp:230–237.
17- Aledani AHE, Khudhair NA, Alrafas HR. EFFECT OF DIFFERENT METHODS OF ANESTHESIA ON PHYSIO-. Dep Vet Hyg Coll Vet Med Univ Basrah,Basrah,Iraq. 2020. vol:19. iss:1. pp:206–214.
18- Alorabi M, Cavalu S, Al-kuraishy HM, Al-gareeb AI, Mostafa-hedeab G, Negm WA, et al. Biomedicine & Pharmacotherapy Pentoxifylline and berberine mitigate diclofenac-induced acute nephrotoxicity in male rats via modulation of inflammation and oxidative stress. Biomed Pharmacother. 2022. vol:152. iss:June. pp:113225.
19- Abdou RM, El-Maadawy WH, Hassan M, El-Dine RS, Aboushousha T, El-Tanbouly ND, et al. Nephroprotective activity of Aframomum melegueta seeds extract against diclofenac-induced acute kidney injury: A mechanistic study. J Ethnopharmacol. 2021. vol:273. iss:January. pp:113939.
20- LINEAR CHEMICALS cromatest REF 1123005. CREATININE Kinetic colorimetric method, REF 1122005. https://www.linear.es/wp-content/uploads/2018/03/1122005I-Rev.-03.pdf. (Barcelona) SPAIN: LINEAR CHEMICALS, S.L.U. joaquim Costa 18 2a planta. 08390 Montgat (Barc.
21- LINEAR CHEMICALS cromatest REF 1156010. UREA Berthelot REF 1156010. http://linear.es/ficheros/archivos/1156010I-.pdf, Accessed on: 2024 Apr 29. (Barcelona) SPAIN: LINEAR CHEMICALS,SLU joaguim Costa 18 2a planta. 08390 Montgat (Barcelona) SPAIN;
22- Tabacco A, Meiattini F, Moda E TP. Simplified enzymic/colorimetric serum urea nitrogen determination. Clin Chem. 1979. vol:25. iss:2336–337.
23- Samarghandian S, Azimi-nezhad M, Farkhondeh T. ScienceDirect Anti-oxidative effects of curcumin on immobilization-induced oxidative stress in rat brain , liver and kidney. Biomed Pharmacother. 2017. vol:87. pp:223–229.
24- Olatosin TM, Akinduko DS, Uche CZ. Antioxidant capacity of Moringa oleifera seed oil against CCl 4 -induced hepatocellular lipid peroxidation in wistar albino rats. Eur J Exp Biol. 2014. vol:4. iss:1. pp:514–518.
25- Hanan H. Hagar, Azza El Medany, Eman El Eter MA. Ameliorative effect of pyrrrolidinedithiocarbamate on acetic acid-induced colitis in rats. Eur J Pharmacol. 2007. vol:554. pp:69–77.
26- Buege JA, Aust SD. MICROSOMAL LIPID PEROXIDATION. MICROSOMAL ELECTRON TRANSPORT AND CYT P-450. 1975. p. 302–310.
27- Hasanvand A, Abbaszadeh A, Darabi S, Nazari A, Gholami M. Evaluation of selenium on kidney function following ischemic injury in rats ; protective effects and antioxidant activity. Nickan Res Inst. 2017. vol:6. iss:2. pp:93–98.
28- Zhang X, Donnan PT, Bell S, Guthrie B. Non-steroidal anti-inflammatory drug induced acute kidney injury in the community dwelling general population and people with chronic kidney disease : systematic review and meta-analysis. BMC Nephrol. 2017. vol:18. iss:256. pp:1–12.
29- Uri D, Sabatino D. Nonsteroidal anti-inflammatory drug induced acute kidney injury ; A review and case study. J Ren Inj Prev. 2020. vol:9. iss:4.
30- Kocak AO, Aygormez S, Leylek HE, Tuna S, Gur A, Ertener O, et al. Can spesific biomarkers be used to enlighten the major mechanisms of acute high dose diclofenac sodium-related nephrotoxicity? EAJEM-45467: Research Article. p. 1–14.
31- Ulubay M, Yurt KK, Kaplan AA, Atilla MK. The use of diclofenac sodium in urological practice: A structural and neurochemical based review. J Chem Neuroanat. 2017.
32- E. J. HICKEY, R.R.RAJE, V.E.REID, S.M.GROSS and SDR. DICLOFENAC INDUCED IN VIVO NEPHROTOXICITY MAY INVOLVE OXIDATIVE STRESS-MEDIATED MASSIVE GENOMIC DNA FRAGMENTATION AND APOPTOTIC CELL DEATH E. Free Radic Biol Med. 2001. vol:31. iss:2. pp:139–152.
33- Ahmed AY, Gad AM, El-raouf OMA. Curcumin ameliorates diclofenac sodium-induced nephrotoxicity in male albino rats. Department of Pharmacology, National Organi- zation forDrugControl and Research, NODCAR, Giza, Egypt. 2017. p. 1–5.
34- Nouri A, Heidarian E. Nephroprotective effect of silymarin against diclofenac- induced renal damage and oxidative stress in male rats. J Herbmed Pharmacol Nephroprotective. 2019. vol:8. iss:2. pp:146–152.
35- Owumi S, E., Dim, U. J. Biochemical alterations in diclofenac-treated rats: effect of selenium on oxidative stress, inflammation, and hematological changes. Toxicol Res Appl. 2019. vol:3. pp:1–10.
36- Yasmeen T, Qureshi GS, Perveen S. Adverse effects of Diclofenac sodium on renal parenchyma of adult albino rats. J Pak Med Assoc. 2007. vol:57. iss:7. pp:349–351.
37- Alabi1 Q.K., Akomolafe R.O., Adefisayo M.A., Olukiran O.S., Nafiu A. O., Fasanya M.K. OAA. Kolaviron attenuates diclofenac-induced nephrotoxicity in male Wistar rats Journal: Appl Physiol Nutr Metab. 2018. pp:1–50.
38- Alabi QK, Akomolafe RO. Kolaviron Diminishes Diclofenac-Induced Liver and Kidney Toxicity in Wistar Rats Via Suppressing Inflammatory Events, Upregulating Antioxidant Defenses, and Improving Hematological Indices. Dose-Response. 2020. vol:18. iss:1. pp:1–12.
39- Moradi A, Abolfathi M, Javadian M, Heidarian E, Roshanmehr H, Khaledi M, et al. Gallic Acid Exerts Nephroprotective , Anti-Oxidative Stress , and Anti- Inflammatory Effects Against Diclofenac-Induced Renal Injury in Malerats. Arch Med Res Orig. 2020.
40- Shakibaie M, Forootanfar H, Jafari E, Rahimi HR. Ondansetron enhanced diclofenac ‐ induced nephrotoxicity in mice. J Biochem Mol Toxicol. 2019. iss:April. pp:1–6.
41- Nouri A, Heidarian E. Ameliorative effects of N ‐ acetyl cysteine on diclofenac ‐ induced renal injury in male rats based on serum biochemical parameters , oxidative biomarkers , and histopathological study. J Food Biochem. 2019. iss:December 2018. pp:1–9.
42- Abiola TS, Adebayo OC, Babalola OO. Diclofenac-Induced Kidney Damage in Wistar Rats : Involvement of Antioxidant Mechanism. J Biosci Med. 2019. vol:7.
43- Milanovic D, Id SP, Brkic M, Avramovic V. Short-Term Fish Oil Treatment Changes the Composition of Phospholipids While Not Affecting the Expression of Mfsd2a Omega-3 Transporter in the Brain and Liver of the 5xFAD Mouse Model of Alzheimer ’ s Disease. MDPI. 2018. vol:10. iss:1250. pp:1–19.
44- Shioda R, Jo-watanabe A, Lee-okada H, Yasukawa K. Dietary intake of n-3 polyunsaturated fatty acids alters the lipid mediator pro fi le of the kidney but does not attenuate renal insuf fi ciency. Biochem Biophys Res Commun. 2021. vol:582. pp:49–56.
45- Gomes S, Monte MG, Polegato BF, Romualdo GR. Protective Effects of Omega-3 Supplementation against Doxorubicin-Induced Deleterious Effects on the Liver and Kidneys of Rats. MDPI. 2023. vol:28. iss:3004. pp:1–14.
46- Abdullah TA, Othman HK. Protective Effects of Omega3 on CCl 4 -Induced Oxidative Stress and Nephrotoxicity in Female Albino Rats. Indian J Public Heal Res Dev. 2019. vol:10. pp:2275–2280.
47- Perez-rojas JM, Kassem KM, Beierwaltes WH, Garvin JL, Herrera M. Nitric oxide produced by endothelial nitric oxide synthase promotes diuresis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298. 2026. vol:48202. pp:1050–1055.
48- Zanetti M, Cappellari GG. Omega 3 Polyunsaturated Fatty Acids Improve Endothelial Dysfunction in Chronic Renal Failure : Role of eNOS Activation and of Oxidative Stress. Nutrient. 2017. vol:9. iss:895. pp:1–11.
49- Abdul B, Mohammed G, Alshawi NN. INTERNATIONAL JOURNAL OF COMPREHENSIVE PHARMACY POSSIBLE PROTECTIVE EFFECT OF EICOSAPENTANOIC ACID / DOCOSAHEXANOIC ACID ON METHOTREXATE-INDUCED NEPHROTOXICITY IN RATS ANIMALS & METHOD. Int J Compr Pharm. 2015. vol:03. iss:04. pp:1–6.
50- W. Khan, N. Arivarasu, S. Priyamvada, S.A. Khan, SH. Khan AY. Protective effect of w-3 pol yunsaturated fatty acids (PUFA) on sodium nitr ite induced nephrotoxicity and oxidative damage in rat kidney. J OFF UNCTIONAL FOODS. 2013. pp:956–967.
51- Fattori V, Borghi SM, Guazelli CFS, Giroldo AC, Crespigio J, Bussmann AJC, et al. Vinpocetine reduces diclofenac-induced acute kidney injury through inhibition of oxidative stress, apoptosis, cytokine production, and NF-κB activation in mice. Pharmacol Res. 2017. vol:120. iss:2017. pp:10–22.
52- بسيط. س،. تقييم كفاءة السيلينيوم في الوقاية من السمية الكلوية المحرضة بواسطة ديكلوفيناك الصوديوم لدى الجرذان. 2022. 1–130 p.
53- Huo X, Meng Q, Wang C, Wu J, Wang C, Zhu Y, et al. Protective effect of cilastatin against diclofenac-induced nephrotoxicity through interaction with diclofenac acyl glucuronide via organic anion transporters. Br J Pharmacol. 2020. vol:177. iss:9. pp:1933–1948.
54- Mustafa HN, Alkan I, Deniz ÖG, Altunkaynak BZ, Annaç E, Kaplan S. A study on the toxic effect of different doses of diclofenac sodium on the development of the kidney in the postnatal period. Int J Morphol. 2019. vol:37. iss:3. pp:877–884.
55- Ibrahim NA, Moneam Shamardl HA, Elsayed AM, Ahmed EI, El-Amir AM, Boshra EF, et al. The possible protective effect of chlorophyllin and vitamin D3 on non-steroidal anti-inflammatory drug induced renal injury in adult albino rat. Syst Rev Pharm. 2021. vol:12. iss:2.
56- Hashem KS, Abdelazem AZ, Mohammed MA, Nagi AM, Aboulhoda BE, Mohammed ET, et al. Thymoquinone alleviates mitochondrial viability and apoptosis in diclofenac-induced acute kidney injury ( AKI ) via regulating Mfn2 and miR-34a mRNA expressions. Environ Sci Pollut Res. 2020. pp:1–14.
57- Lucas G. N.,, Leitao A.A., Alencar R.L., Xavier R. M., Daher, El. D. JGB. Pathophysiological aspects of nephropathy caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs. Braz J Nephrol. 2018. vol:41. iss:1. pp:124–130.
58- Elsafty M, Abdeen A, Aboubakr M. Allicin and Omega ‑ 3 fatty acids attenuates acetaminophen mediated renal toxicity and modulates oxidative stress , and cell apoptosis in rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2024. vol:397. iss:1. pp:317–328.