الملخص

خلفية البحث وهدفه: إن تطوير طرائق تحليلية للمنتجات الصلبة التي تحتوي على مواد دوائية ذات ذوبان محدود في الماء هو أحد التحديات الأكثر أهمية في تحليل الثبات. بالإضافة إلى مشاكل التطوير والتحقق من المصدوقية، يتضمن هذا التحدي التأكد من أن هذه الطرائق مؤشرة للثبات. إن الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طرائق للذوبانية والمقايسة بحيث تكون مؤشرة للثبات للمواد الدوائية قليلة الذوبان ضمن أشكالها الجرعية الصلبة والتحقق من مصدوقيتها.

مواد البحث وطرائقه: تم تحليل ومراقبة عينات من مادة الإمباغليفلوزين الدوائية كمثال عن مادة دوائية قليلة الذوبان، بتطبيق الإختبارات الفيزيوكيميائية ذات العلاقة، على مستوى مخبري. تم تطوير اختبارات الذوبانية والمقايسة للشكل الصلب للإمباغليفلوزين بناء على نتائج هذه الإختبارات. من أجل تقييم الخواص المؤشرة للثبات لهذه الطرائق المطورة، تم تطبيقها على عينات المادة الدوائية التي تم إخضاعها إلى ظروف الإجهاد وعينات المنتج الحقيقية التي تقادم عمرها وانتهت صلاحيتها. تم إجراء دراسات التحقق من مصدوقية الطرائق المطورة حسب توجيهات المؤتمر الدولي للمواءمة ICH، وتم استخدام الإختبارات الإحصائية في تقييم معايير التحقق من المصدوقية.

النتائج: تم تحقيق مخطط ذوبانية متدرج باستعمال 900 مل من محلول الوقاء الفوسفاتي(pH=6.8)  كوسط ذوبانية وطريقة المجداف بسرعة 50 دورة/ دقيقة. أثبتت معاملات التشابه والإختلاف قوة الطريقة المميزة لتغيرات التحرر والثبات والصيغة. في طريقة المقايسة بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور المعكوس RP-HPLC، تم تطبيق طور متحرك مؤلف من مزيج مؤلف من الميتانول والأسيتونتريل ومحلول الوقاء الفوسفاتي(pH=3.0) ، بنسبة 30:10:60))، بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة، باستعمال عمود C18 (250 ملم × 4.6 ملم، 5 مكم)، وعند طول موجة الكشف 224 نانومتر. أثبتت اختبارات نقاوة القمة الخواص المؤشرة للثبات لطريقة المقايسة. كانت كل من طرائق الذوبانية والمقايسة خطية (معاملات الإرتباط 0.9996 و0.9999 على الترتيب)، ومضبوطة (متوسط النسبة المئوية للإستعادة 101.64% و99.41% على الترتيب)، ودقيقة (الإنحرافات المعيارية النسبية 1.35% و0.15% بالنسبة للتكرارية و0.19% و0.92% بالنسبة للدقة الوسطية على الترتيب). تم التأكد أيضاً من المتانة (جميع الإنحرافات المعيارية النسبية أقل من 2%).

الإستنتاجات: إن الطرائق المطورة لاختبارات الذوبانية والمقايسة مناسبة من أجل المراقبة الروتينية للجودة، وتمثل وسائل فعالة من أجل تقييم مخططات الثبات الفيزيائي والكيميائي للمنتجات الصلبة التي تحتوي على مادة دوائية قليلة الذوبان: إمباغليفلوزين.

---

كلمات مفتاحية : طريقة مقايسة، تطوير، طريقة ذوبانية، إمباغليفلوزين، مؤشرة للثبات، تحقق من المصدوقية ,Assay method, Development, Dissolution method, Empagliflozin, Stability-indicating, Validation

---

المقدمة Introduction

يعدّ تحديد الخواص الحرجة للجودة Critical Quality Attribute (CQAs) أحد العناصر الرئيسة في آليّة تطبيق مفهوم (الجودة من خلال التصميم Quality by design (QbD)) الذي تحدثت عنه قواعد المؤتمر الدولي للمواءمةInternational Council for Harmanisation (ICH)  في وثيقة ICH Q8، وتعرَّف الخاصية الحرجة للجودة بأنها خاصية أو صفة مميِّزة فيزيائية أو كيميائية أو بيولوجية أو ميكروبيولوجية بحيث يجب أن تكون ضمن حدود أو مجال أو توزع مناسب لكي يَتم التأكد من الجودة المَطلوبِة للمنتج. إن الخواص الحرجة لجودة الأشكال الجرعية الفموية الصلبة هي عادةً تلك السّمات المؤثرة على النقاوة والعيار والتحرر الدوائي والثبات للمنتج [1]. يتم تحديد الخاصية الحرجة لجودة المستحضرات الدوائية بناء على شدة أذيتها للمريض من حيث تأثيرها على الأمان والفعالية، أي الأذية الناتجة عن الفشل في الخضوع لتلك الخاصية [2]. لذلك، تعدّ الذوبانية والمقايسة خواصاً حرجة مؤثرة على جودة المنتجات الدوائية الفموية الصلبة بسبب ارتباطها الوثيق بفعالية وأمان هذه المنتجات، وكان ذلك جليّاً من خلال إدراج الذوبانية والمقايسة من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) Food and Drug Administration كخواص حرجة للجودة في الملف الصادر عنها كمثال مقترح عن ملف ترخيص الأشكال الجرعية مباشرة التحرر [3]. باعتبار أن الذوبانية والمقايسة هي من الخواص الحرجة الأكثر أهمية بالنسبة لتحرير المنتجات الدوائية الصلبة وخاصة المنتجات الدوائية التي تحتوي على مواد دوائية قليلة الذوبان، يعدّ تحليل الذوبانية والمقايسة أيضاً من الإجراءات الأساسية في مراقبة تحرير وثبات المنتجات الدوائية الصلبة. أثناء تطوير الطرائق التحليلية، يعدّ تقييم خواص المادة الدوائية ذات العلاقة بالطريقة المطورة مثل معلومات الذوبان والثبات والإمتصاصية الضوئية من المتطلبات الهامة لعملية التطوير. إن جميع الطرائق التحليلية تحتاج إلى شكل ما من التحقق من مصدوقيتها، بغض النظر فيما إذا كانت الطريقة تستخدم من أجل الثبات أو التحليل أثناء التصنيع أو التحرير أو القبول [4]. تم في هذه الدراسة الإستناد إلى توجيهات الـ ICH في النسخة النهائية من ملف التحقق من مصدوقية الطرائق التحليلية ICH Q2(R2) لأن هذه التوجيهات تطبق على الطرائق التحليلية المستعملة من أجل التحرير واختبار الثبات للمواد والمنتجات الدوائية. يعدّ الإجراء التحليلي الكمي الذي تم التحقق من صلاحيته والذي يمكن أن يكشف عن التغيرات في خواص الجودة ذات العلاقة للمنتج أثناء التخزين إجراءاً مؤشراً للثبات. لإيضاح نوعية/انتقائية اختبار مؤشر للثبات، يجب أن تتضمن الدراسة عينات تحتوي على منتجات التدرك ذات العلاقة. قد تتضمن هذه العينات: العينات التي أضيف إليها بشكل مقصود مواد محددة ذات تداخلات معروفة مع المادة الدوائية، وعينات تم تعريضها إلى ظروف إجهاد فيزيائية وكيميائية مختلفة، وعينات المنتج الحقيقية التي إما تقادم عمرها أو تم تخزينها تحت ظروف الإجهاد [5]. تبدي بعض المواد الدوائية ضعفاً هاماً في ذوبانها في الماء أو ذوباناً معتمداً على درجة الحموضة (pH)، وقد تم تقدير أن أكثر من 40% من المواد الكيميائية الجديدة المستعملة في التطوير الدوائي تم توصيفها على أنها مواد ضعيفة الذوبان في الماء، وتمثل المواد الدوائية ضعيفة الذوبان في الماء تحدياً بالنسبة لصياغة الأشكال الجرعية الصلبة الفموية الصيدلانية فيما يتعلق بتحسين التوافر الحيوي للمادة الدوائية مع الحفاظ على ثبات المنتج الدوائي من الناحيتين الفيزيائية والكيميائية معاً [6]. تناقش هذه الدراسة حالة مادة الإمباغليفلوزين الدوائية باعتبارها مادة قليلة الذوبان جداً في الماء ولأهميتها العلاجية كمادة دوائية نوعية خافضة لسكر الدم من النمط II ولاستطبابها في إنقاص خطر الوفاة القلبية الوعائية والإستشفاء من أجل القصور القلبي بالنسبة لمرضى القصور القلبي وهي من الأدوية الأكثر وصفاً في سورية. إمباغليفلوزين هو مثبط للناقل المشارك صوديوم-جلوكوز SGLT2 . الإسم الكيميائي للإمباغليفلوزين هو:

D-Glucitol,1,5-anhydro-1-C-[4-chloro-3-[[4-[[(3S)-tetrahydro-3-furanyl]oxy]phenyl]methyl]phenyl]-, (1S).

الصيغة المجملة:C₂₃H₂₇ClO₇ ، الوزن الجزيئي: 450.91. يبين الشكل (1) البنية الكيميائية للمادة الدوائية (إمباغليفلوزين Empagliflozin).

قد حصل المستحضر المشابه العالمي ذو الإسم التجاري (جارديانس Jardiance) الذي يحتوي في تركيبه مادة الإمباغليفلوزين كمادة دوائية، على الموافقة المبدئية للـ FDA في عام 2014 [7]. تم إدخال مادة الإمباغليفلوزين الدوائية إلى لائحة الأدوية الوطنية الصادرة عن وزارة الصحة السورية بتاريخ 14/08/2017 ضمن الأدوية المستخدمة في علاج داء السكري [8]، وهي مادة غير دستورية حتى تاريخه [10,9]. قد تحدثت العديد من التقارير المنشورة عن تطوير طرائق ذوبانية ومقايسة لأشكال صلبة للإمباغليفلوزين، إلا أنها تفتقد التركيز على القدرة المؤشرة للثبات لهذه الطرائق المطورة. لذلك، قد هدفت دراستنا إلى تطوير طرائق تحليلية مؤشرة للثبات لتحديد ذوبانية ومقايسة الإمباغليفلوزين ضمن المنتجات الصلبة، ولتقدير مدى ملاءمة هذه الطرائق لمراقبة الثبات الفيزيائي والكيميائي للإمباغليفلوزين ضمن الصيغ الصيدلانية الصلبة، وتقييم القوة المؤشرة للثبات لهذه الطرائق، والتحقق من مصدوقيتها.

المواد والطرائق Materials and Methods

المواد الكيميائية والكواشف:

تم التزويد بعينة مادة الإمباغليفلوزين الدوائية (النقاوة: 98.8%) من Carbosynth)، المملكة المتحدة)، هيدروكسي بروبيل سيلولوزBASF) ، ألمانيا(، فوسفات البوتاسيوم أحادية الاساسSigma Aldrich) ، ألمانيا(، حمض الفوسفور85% (Fisher Scientific، الهند)، ميتانول معد للـ HPLC  (Merck، ألمانيا(، أسيتونتريل معد للـ HPLC  (Merck، ألمانيا(، ماء معد للـ HPLC (جهاز التزويد بالماء المعد للـ HPLC، سوريا)، محلول الماء الأكسجيني 20 % (صيدلية محلية، سوريا). تم شراء مضغوطات المشابهَين المحلي (إيمبا®) والعالمي (جارديانس®) من السوق الدوائية المحَلِّيِّة السورية. تم تحضير المبعثرات الصلبة للإمباغليفلوزين ضمن الهيدروكسي بروبيل سيلولوز باستخدام طريقة تبخير المذيب.

الأجهزة:

ميزان إلكتروني حساس (Sartorius، ألمانيا)، جهاز الأمواج فوق الصوتية WiseClean) ، كوريا(، فرن يمكن التحكم بدرجة حرارته Selecta)، إسبانيا(، جهاز قياس الـ pH (Crison، إسبانيا(. تم إجراء تحاليل الذوبانية باستعمال جهاز Erweka^® المتعدد الأوعية المجهز بمضخة وحاقن ذاتي وسخان ضابط للحرارة. تم إجراء التسجيلات الطيفية وقياسات الإمتصاص بواسطة جهاز الإمتصاصية للأشعة فوق البنفسجيةUV  (Shimadzu LC-20AT ، اليابان) باستعمال خلايا من الكوارتز قطرها 10 ملم، جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء HPLC Shimadzu LC-20AT) ، اليابان( المجهز بمضخة وحاقن ذاتي وفرن والمصفوفة الديودية Photodiode Array (PDA) وبرنامج LC-Solution  منShimadzu . أعمدة (150 ملم 4.6 × ملم) و(250 ملم 4.6 × ملم) تحتوي على طور معكوس C18  بتعبئة 5 ميكرومتر (Agilent، USA).

شروط اختبار الذوبانية:

تم إجراء اختبار الذوبانية باستعمال جهاز II USP بطريقة المجداف. تم تطبيق الإختِبار على كمية من العينات الصلبة تكافئ عيار المادة الدوائية (10 أو 25 ملغ)، باستعمال الحجم المحدد (500 أو 900 مل) وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 ± 0.5^◦م، وبتطبيق سرعة الدوران المحددة (50 أو 75 دورة/دقيقة)، ثم تم سحب 10 مل من عينات الذوبانية عند النقاط الزمنية المحددة (5، 10، 15، 20، 25، 30 دقيقة)، وترشيح العينات من خلال مرشحة أبعادها 10 مكم. تم قياس امتصاصية محاليل العينات دون تمديد بالمقارنة مع امتصاصية محلول معياري للإمباغليفلوزين، باستعمال جهاز قياس الإمتصاصية UV، وحساب الذوبانية، ثم تم رسم النسبة التراكمية للتحرر مقابل الزمن للحصول على مخططات التحرر.

الشروط الكروماتوغرافية:

تم تحضير الطور المتحرك المبدئي المؤلف من مزيج متساو الحجوم من الطور المائي (الوقاء الفوسفاتي) والطور العضوي (الأسيتونتريل)، ثم تم إجراء عدة تجارب بتطبيق نسب مختلفة من الأسيتونتريل والميتانول والوقاءات وقيم مختلفة للـ pH وأعمدة مختلفة، وتقييم الفصل والنقاوة وزمن الإحتباس لقمة الإمباغليفلوزين. كانت الشروط الكروماتوغرافية المثلى: إن الطور المتحرك الأمثل مؤلف من الميتانول والأسيتونتريل والوقاء الفوسفاتي pH=3.0 (50mM)، بنسبة (30:10:60)، عمود (250 ملم 4.6 × ملم) يحتوي على طور معكوس C18  بتعبئة 5 ميكرومتر،  طول الموجة  224 نانومتر، معدل التدفق 1 مل/دقيقة، درجة الحرارة 30◦م، حجم الحقنة: 20 ميكروليتر، زمن التجربة: 10 دقائق.

تحضير المحلول المعياري ومحلول المقايسة:

تم نقل 50 ملغ موزونة بدقة من مادة الإمباغليفلوزين المعيارية إلى دورق 100 مل وحلها وتمديدها باستعمال مزيج الأسيتونتريل والماء (50:50)، ثم تم تمديد المحلول بالمذيب ذاته للحصول على المحلول المعياري الأساسي بتركيز 500 مكغ/مل. تم تمديد المحلول باستعمال الماء، والتحريك لمدة 10 دقائق للحصول على محلول معياري بالتركيز المطلوب. تم نقل كمية مقاسة بدقة من المنتج الصلب تكافئ  25ملغ من الإمباغليفلوزين إلى دورق حجمي سعة 50 مل، وإذابتها في مزيج الأسيتونتريل والماء (50:50) والتمديد بالميتانول حتى الحجم، وتحريك المحلول لمدة 10 دقائق. تم ترشيح المحلول الناتج، وتم التمديد بالميتانول حتى الحجم، ثم التحريك لمدة 10 دقائق، للحصول على محلول المقايسة.

دراسات التدرك:

لتقييم القوة المؤشرة للثبات لطريقة الذوبانية، استُعمِلت عينات المشابه العالمي (جارديانس) المنتهية الصلاحية، ولتقييم القوة المؤشرة للثبات لطريقة المقايسة، تم إجراء دراسات التدرك بالإجهاد، حيث تضمنت طرائق التدرك: التدرك الحراري والتدرك بالأكسدة والتدرك الضوئي. جرى التدرك الحراري بحفظ الإمباغليفلوزين في الفرن عند درجة الحرارة 70◦م لمدة يومين، وتم التدرك بالأكسدة بمعالجة المادة الدوائية بمحلول الماء الأكسجيني 3%، وتم التدرك الضوئي بتعريض المادة الدوائية إلى ضوء الشمس لمدة 24 ساعة، ثم تم تحضير ثلاثة محاليل من المادة المتدركة بتركيز 20 مكغ/مل، وحقن المحاليل مباشرة بجهاز الـ HPLC ثم إجراء اختبار نقاوة قمة الإمباغليفلوزين.

دراسات تطوير طرائق الذوبانية والمقايسة:

تم تطوير طرائق ذوبانية ومقايسة مؤشرة للثبات للشكل الصلب للإمباغليفلوزين، حيث بدأ العمل بدراسة الخواص الفيزيوكيميائية لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية، من خلال دراسة ذوبانها في المحلات العضوية المختلفة ودرجة التأين pKa ومعامل التجزئة Log P الخاص بها. تم تسجيل طيف الإمتصاصية لمحلول الإمباغليفلوزين باستعمال جهاز الـ UV في المجال 400 – 200 نانومتر. تمت دراسة ذوبان الإمباغليفلوزين في أوساط مختلفة وهي: محلول حمض كلور الماء 0.1N ومحلول الوقاء الخلاتي pH=4.5 ومحلول الوقاء الفوسفاتي pH=6.8 ومحلول الوقاء الفوسفاتي pH=7.4 والماء المنقى، بتطبيق طريقة الـ USP (طريقة الخض بالدورق)، ثم الترشيح  باستخدام مرشحة أبعادها 0.45 مكم، ثم تمديد المحاليل ومعايرتها باستعمال جهاز الـ  UV، وحساب الذوبان، حيث تم تكرار كل قياس ثلاث مرات، ثم أُدرِجَت النتائج في الجدول (1) على شكل قيمة (المتوسط ± الإنحراف المعياري). تم أيضاً إجراء اختبار الثبات اعتماداً على pH المحلول، حيث تم التدرك الحمضي بمحلول حمض كلور الماء 0.1 N والتدرك القلوي بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N والتدرك المعتدل بالماء المنقى. تم حفظ المحاليل لمدة شهر واحد، ثم مقايسة الإمباغليفلوزين فيها، وتكرار كل قياس ثلاث مرات، وأُدرِجَت النتائج في الجدول (2) على شكل قيمة (المتوسط ± الإنحراف المعياري).

دراسات التحقق من مصدوقية الطرائق المُطوَّرَة:

تم إجراء دراسات التحقق من مصدوقية الطرائق المطوَّرَة حسب قواعد الـICH  [5]، حيث تم تقييم النوعيةSpecificity  والمضبوطية Accuracy والدقة Precision (التكرارية Repeatability والدقة الوسطية Precision) والخطية Linearity والمجال Range والمتانة Robustness. لتقييم نوعية طريقة الذوبانية، تم تسجيل طيف الـ UV للإمباغليفلوزين ومزيج السواغات، وتقييم تداخل امتصاص الإمباغليفلوزين مع امتصاص السواغات. بالنسبة لطريقة المقايسة، تم تسجيل المخططات الكروماتوغرافية للمنتج الصلب للإمباغليفلوزين ومزيج السواغات، وتقييم تداخل قمة الإمباغليفلوزين مع قمم السواغات، وتم إجراء اختبار نقاوة القمة للإمباغليفلوزين وتسجيل المخططات الكروماتوغرافية للمنتج الصلب للإمباغليفلوزين بعد التدرك بالإجهاد. تم تقييم الخطية بتحضير سلسلة معيارية مؤلَّفة من ستة محاليل ممددة لكل من الطريقتين للحصول على تراكيز للإمباغليفلوزين تقع ضمن المجال (1 مكغ/مل – 30 مكغ/مل) وتسجيل الإستجابات للمحاليل المعيارية المحضرة، وتم تقييم الخطية من خلال رسم خط الإرتباط لكل طريقة وحساب معاملات الإرتباط والميل ونقطة التقاطع لكل من طريقتي الذوبانية والمقايسة باستعمال طريقة الإرتباط الخطي. تم تقدير المضبوطية بإضافة كميات من مادة الإمباغليفلوزين المعيارية إلى مزيج السواغات ضمن الوسط الموجود في وعاء الذوبانية وإضافة كميات من محلول الإمباغليفلوزين المعياري إلى مزيج السواغات ضمن محلول العينة للإمباغليفلوزين بالنسبة لطريقة المقايسة، للحصول على 9 قياسات عبر ثلاثة تراكيز (ثلاثة تكرارات لكل تركيز)، وتم حساب نسبة الإسترداد ومتوسط النسبة المئوية للإستعادة Mean Recovery لكل مستوىً من التركيز. تم تقدير تكرارية طريقة الذوبانية من خلال سحب 6 عينات من وعاء الذوبانية ذاته بعد التأكد من الذوبان الكامل، وتم إيضاح تكرارية طريقة المقايسة من خلال سحب 6 عينات من محلول المقايسة، أي إجراء 6 قياسات بتركيز الإختبار وحساب الإنحراف المعياري النسبي RSD، وتمت إعادة الإجراءات ذاتها في اليومين الثاني والثالث لتقدير الدقة الوسطية للطريقتين. تم تحديد متانة الطرق بتطبيق تعديلات على بعض المعايير التحليلية، أي تركيب وسط الذوبانية وpH وسط الذوبانية وسرعة التحريك بالنسبة لطريقة الذوبانية، وتركيب الطور المتحرك وpH الطور المتحرك ومعدل التدفق بالنسبة لطريقة المقايسة، تم استعمال تركيز الإختبار من أجل جميع تجارب معايير المتانة. تم حساب حد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOQ) بناء على الإنحراف المعياري للإستجابة وميل خط الإرتباط بتطبيق العلاقتين (1) و(2):

حد الكشف (LOD) = 3.3 x (الإنحراف المعياري للإستجابة/ميل خط الإرتباط)      العلاقة (1)

الحد الكمي (LOQ) = 10 x (الإنحراف المعياري للإستجابة/ميل خط الإرتباط)       العلاقة (2)

النتائج Results

نتائج دراسة الخواص الفيزيوكيميائية: تبين أن الإمباغليفلوزين مادة ذوابة بشكل خفيف جداً في الماء، وذوابة بصعوبة في الميتانول، وذوابة بشكل خفيف في الأسيتونتريل والإيتانول، وذوابة في مزيج أسيتونتريل/ماء 50%، وغير ذوابة عملياً في التولوين. إن قيمة درجة التأين للإمباغليفلوزين هي 12.57 pK_a= تقريباً، وإن قيمة معامل التجزئة للإمباغليفلوزين log P = 1.7. تصنَّع المادة دوماً بشكل وحيد هو الشكل البلوري ولم يوصف لها تعدد في الشكل في تقارير المنشورات حتى تاريخه. لدى تسجيل طيف الإمتصاص للأشعة فوق البنفسجية UV لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية في المجال الموجي 200 – 400 نانومتر، لوحظ أنها تبدي امتصاصاً أعظمياً عند طول الموجة 224 نانومتر كما هو مبين في الشكل (2).

ويبين الجدول (1) أن مادة الإمباغليفلوزين قد أبدت ذوباناً قليلاً (أقل من 1 ملغ/مل) عبر المجال الفيزيولوجي للـ pH، وكان الذوبان أعظمياً عند قيم pH منخفضة، وأبدت ذوباناً شحيحاً في الماء من رتبة (ذوابة بشكل خفيف جداً very slightly soluble) حسب التصنيف الدستوري للذوبان.

وبينت نتائج اختبار ثبات الإمباغليفلوزين اعتماداً على الـ pH الموضَّحة في الجدول (2) أن الثبات يتغير بشكل مهم بتغير الـ pH، ويكون في قيمته الدنيا في الأوساط الحمضية، وأن التدرك في الوسط الحمضي هو أكبر منه في الوسط القلوي، ويتزايد التدرك في الأوساط الحمضية القوية والقلوية القوية مع ثبات أعظمي في المجال المعتدل إلى قليل الحموضة، حيث تبين أن قيمة pH الثبات الأعظمي للإمباغليفلوزين تساوي pH=6.8.

نتائج دراسة تطوير طريقة الذوبانية: يبين الجدول (3) الأوساط والشروط المختلفة المستخدمة في تطوير طريقة الذوبانية للشكل الصلب للإمباغليفلوزين، كما تبين الأشكال (3) و(4) و(5) مخططات الذوبانية التي تثبت القوة المميزة للتحرر وللثبات ولتغيرات الصيغة والتصنيع.

نتائج دراسة تطوير طريقة المقايسة: يبين الجدول (4) الأطوار المتحركة والشروط المختلفة المستخدمة في تطوير طريقة المقايسة للشكل الصلب للإمباغليفلوزين، وصولاً إلى الشروط الكروماتوغرافية المثلى للطريقة (الشروط رقم 7)، ويبين الشكل (6) المخطط الكروماتوغرافي النموذجي للإمباغليفلوزين بعد تطبيق الشروط الكروماتوغرافية المثلى، حيث كان زمن الإحتباس لقمة الإمباغليفلوزين 6.3 دقيقة.

نتائج دراسة التحقق من مصدوقية الطرائق المطوَّرة: يبين الشكل (7) أطياف امتصاص الـ UV المسجلة لعينة مزيج السواغات وعينة مادة الإمباغليفلوزين الدوائية معاً، بهدف تقييم نوعية طريقة الذوبانية، حيث تبين عدم وجود تداخل بين امتصاص السواغات وامتصاص الإمباغليفلوزين عند طول موجة الإمتصاص الأعظمي للإمباغليفلوزين (224) نانومتر، حيث كانت نسبة التداخل مساوية 0.78% فقط.

بهدف تقييم نوعية طريقة المقايسة، تم تسجيل المخططات الكروماتوغرافية الممثِّلة لعينة المنتج الدوائي وعينة مزيج السواغات، حيث بينت هذه المخططات عدم وجود تداخل بين قمم السواغات الصيدلانية وقمة الإمباغليفلوزين عند زمن احتباس الإمباغليفلوزين (6.3 دقيقة) كما هو مبين في الشكل (8)، وكانت قيمة معامل الميز Resolution لقمة الإمباغليفلوزين عن أقرب قمة مساوية 10.09، ويبين الشكل (9) منحني النقاوة الكروماتوغرافية لقمة الإمباغليفلوزين، حيث بين اختبار النقاوة الكروماتوغرافية أن قيمة عتبة النقطة المفردةSingle-point threshold  أقل من قيمة قرينة نقاوة القمةPeak  purity index  (أعطى جهاز الـ HPLC النتيجة التالية: (Impurity: Not Detected وأن هذه القمة نقية ولا تعود إلى أكثر من مكون واحد، كما تم تسجيل  المخططات الكروماتوغرافية الممثِّلة لعينة المنتج الدوائي بعد التدرك بالأكسدة والتدرك الضوئي والتدرك الحراري وكانت النتائج مقبولة أيضاً وتؤكد الفصل الكامل لنواتج التدرك عن قمة الإمباغليفلوزين كما هو مبين في الشكل (10).

الشكل (10): المخططات الكروماتوغرافية للإمباغليفلوزين بعد التدرك بالإجهاد

أ) التدرك بالأكسدة، ب) التدرك الضوئي، جـ) التدرك الحراري

بهدف تقييم خطية الطرق المطورة للذوبانية والمقايسة، يبين الشكل (11) منحنيات السلسلة المعيارية للإمباغليفلوزين المعبرة عن الخطية.

يلخص الجدول (5) نتائج دراسة التحقق من مصدوقية طرائق الذوبانية والمقايسة المطوَّرة.

المناقشة Discussion

تطوير طريقة الذوبانية المميزة للتحرر: بدأت عملية التطوير بتطبيق شروط طريقة الذوبانية التي نصت عليها الـ FDA، وهذه الشروط هي: الجهاز المستعمل:USP apparatus 2 ، الطريقة: طريقة المجداف Paddle Method، الوسط: محلول حمض كلور الماء 0.1N، لا يوجد مادة خافضة للتوتر السطحي في الوسط، حجم الوسط: 500 مل، سرعة الدوران: 50 دورة/دقيقة، درجة الحرارة: °37 ± °0.5م. بالنسبة للمنتجات الدوائية الفموية الصلبة مباشرة التحرر التي تحتوي على مادة دوائية عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي، فإن الحدود المقبولة للذوبانية هي Q=80% خلال 30 دقيقة، وذلك حسب الإرشادات في دليل الذوبانية الصادر عن الـ FDA عام 2018 FDA Dissolution Guidance 2018 [11]. بناءً على نظام التصنيف الحيوي الصيدلاني Biopharmaceutical Classification System (BCS)، تصنف المادة الصيدلانية الفعالة على أنها عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي إذا كانت الجرعة العلاجية الفردية الأعلى منحلة بشكل كامل في حجم أقل أو يساوي 250 مل من الأوساط المائية على طول مجال الـ pH الذي يتراوح من pH=1.2 إلى pH=6.8 عند درجة الحرارة 37^◦م ± 1^◦م [12]. قد تم استعمال الذوبان الأدنى للإمباغليفلوزين المقاس في المجال الفيزيولوجي للـ pH من أجل تصنيف ذوبان الإمباغليفلوزين وكان الذوبان الأدنى مساوياً 0.159 ملغ/مل كما هو مبين في الجدول (1)، ولدى حساب نسبة (جرعة عظمى إلى ذوبان أدنى) قد تبين أنها تساوي 157.23 مل، أي أن حجم ذوبان الجرعة العظمى أقل من 250 مل، لذلك تعتبر مادة الإمباغليفلوزين الدوائية عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي بناء على تصنيف الـ BCS، وبالتالي فإن المواصفة المقبولة للذوبانية للشكل الصلب مباشر التحرر للإمباغليفلوزين هي Q=80% خلال 30 دقيقة، ونظراً لأن مادة الإمباغليفلوزين ذات نفاذية معوية قليلة، فقد تم التأكد من تصنيف الإمباغليفلوزين بأنها مادة تنتمي إلى المجموعة BCS Class III. إن الشروط الحمضية للأوساط تعكس ظروف المعدة التي تم تقدير حجمها بـ 250 مل عندما يتم بلع كوب من الماء مع الشكل الصيدلاني الفموي، إلا أن حجم الوسط هذا قليل جداً عندما يستعمل بتطبيق طريقة المجداف أو طريقة السلة. يعتبر الحجم 500 مل لوسط الذوبانية حجماً مناسباً للتأكد من تحقق شروط الإنغماس Sink conditions لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية نظراً لكونها مادة عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي وخاصة في محلول حمض كلور الماء 0.1N كما هو مبين في الجدول (1)، حيث بينت النتائج أن محلول حمض كلور الماء 0.1N قد حقق ذوباناً قدره 0.304 ملغ/مل أي أنه يساوي أكثر من 10 أضعاف ذوبان الجرعة العظمى من هذه المادة والذي يساوي 0.0277 ملغ/مل (ناتج تقسيم الجرعة العظمى 25 ملغ على حجم  900مل)، أي أنه قد تحققت شروط الإنغماس بزيادة كبيرة بدءاً من هذا الوسط، إلا أنه تم أيضاً استعمال حجم الوسط 900 مل ضمن الأوساط المستخدمة في عملية تطوير طريقة الذوبانية لدراسة تأثير حجم الوسط على مخطط الذوبانية. تم أيضاً تطبيق أوساط ذوبانية أخرى من مجال الـ pH الفيزيولوجي بالإضافة إلى أوساط محلول حمض كلور الماء 0.1N، حيث بينت نتائج دراسة الثبات المعتمد على قيمة الـ pH الموضحة في الجدول (2)، أن مادة الإمباغليفلوزين تميل إلى التدرك عند قيم pH منخفضة ومرتفعة، حيث بلغت نسبة تدرك هذه المادة في الأوساط الحمضية والقلوية حوالي 6.0% و 4.0% على الترتيب خلال ساعتين فقط، بينما لم تتجاوز نسبة التدرك في الأوساط المعتدلة النسبة 0.5%، ولذلك تم اختيار محلول الوقاء الفوسفاتي pH=6.8 كوسط ذوبانية معتدل يضاف إلى عملية التطوير لأنه يحقق ثباتاً كافياً للمادة الدوائية خلال فترة قياس ذوبانيتها، كما أنه قد بينت دراسة الذوبان أن ذوبان الإمباغليفلوزين في محلول الوقاء الفوسفاتي pH=6.8 يساوي تقريباً ذوبانها في الوسط الحيوي المشابه. يمكن أيضاً اختيار الماء المنقى لكونه وسط معتدل الحموضة، لكن الذوبان المقاس في الماء لا يدلّ دوماً عن الذوبان في المجرى الهضمي، ولذلك فإن استعمال الذوبان المائي للتنبؤ عن الإمتصاص الفموي للمادة الدوائية قد يؤدي بشكل ملحوظ إلى تقدير لِقيَم أقل من القيم الفعلية للتوافر الحيوي، خاصة بالنسبة للمواد الدوائية قليلة الذوبان والمحبة للدسم. كما أن الماء يفقد القدرة الموقية ولذلك قد تتغير قيمة pH الوسط في بعض الحالات عندما تنحل المادة الدوائية. بالإضافة إلى ذلك، ولأن الماء لا يمثل البيئة الحمضية المعوية، فإنه لا يعتبر وسطاً متعلقاً بالحالة الفيزيولوجية. لذلك لم يتم تقييم الماء كوسط ذوبانية ضمن عملية التطوير. كانت كلاً من سرعات الدوران 50 دورة/دقيقة و75 دورة/دقيقة مميزة للتحرر إلا أنه قد تم اختيار السرعة 50 دورة/دقيقة لأن هذه السرعة لم تسبب ظاهرة تشكل مخروط من المواد غير المنحلة في أسفل وعاء الذوبانية (Coning)، تلك الظاهرة التي تسبب عادة نقصاناً في تحرر الدواء، كما أن هذه السرعة كانت كافية أيضاً لتحقيق النسبة المقبولة من الذوبانية نظراً لأن مادة الإمباغليفلوزين عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي وقد تم تصنيفها ضمن المجموعة BCS Class III. يبين الجدول (3) الأوساط والشروط المختلفة المستخدمة في تطوير طريقة الذوبانية للشكل الصلب للإمباغليفلوزين. بيَّن اختبار الذوبانية أن الإمباغليفلوزين قد حقق شروط الإنغماس Sink conditions في جميع الأوساط التي تم اختبارها مع ذوبانية سريعة لا تقل عن 80% خلال 30 دقيقة، حيث تراوحت النسبة المنحلة من المادة الدوائية في هذه الأوساط بين 85.89% و98.41% خلال 30 دقيقة، كما هو مبين في الجدول (3)، وهي ضمن الحدود المقبولة للذوبانية للمنتجات الدوائية الفموية الصلبة مباشرة التحرر التي تحتوي على مادة دوائية عالية الذوبان في المجال الفيزيولوجي (لا تقل الذوبانية عن Q=80% خلال 30 دقيقة) حسب الإرشادات في دليل الذوبانية الصادر عن الـ FDA عام 2018 [11]، ولذلك لم يتم تقييم استعمال مادة خافضة للتوتر السطحي في كل الأوساط التي تم تطبيق اختبار الذوبانية عليها. إن المنتج ذو نمط تحرر مباشر، ولذلك قد تم إعطاء الأولوية في دراسة مخططات الذوبانية للأوساط التي تشابه السائل المعدي الذي يحقق الذوبانية الأفضل (وهو هنا وسط محلول حمض كلور الماء 0.1N) والأوساط التي تشابه السائل المعوي الذي يحقق الثبات والإمتصاص الأفضل (وهو هنا وسط محلول الوقاء الفوسفاتي pH=6.8)، وقد تم رسم مخططات الذوبانية لهذه الأوساط بهدف مقارنة نمط وتدرج التحرر فيما بينها. تم اختيار وسط الذوبانية ذو الرقم 6 لأنه قد أعطى مخططاً بطيئاً وأكثر تدرجاً على طول زمن التحليل مما يحفز القوة المميزة لطريقة الذوبانية، حيث تعتمد طريقة التطوير على الهدف المرجو من الطريقة المطورة، وبما أن القوة المميزة للطريقة هي من أهم الأهداف في تطوير طريقة الذوبانية، يعتبر الإختبار الذي يعطي تدرجاً أكبر في سرعة الذوبانية أكثر أهمية من أجل تقييم جودة ذوبانية الشكل الصلب، كما أن هذا الوسط قد حقق الذوبانية المئوية المطلوبة خلال الفترة الزمنية الموصوفة (لا تقل الذوبانية عن 80% خلال 30 دقيقة) كما هو مبين في الشكل (3). لذلك، إن الشروط المثلى التي تم اختيارها مبدئياً لطريقة الذوبانية هي الشروط المتعلقة بالوسط الأخير رقم 6، وهي: الجهاز المستعمل:USP apparatus 2 ، الطريقة: طريقة المجداف Paddle Method، تركيب الوسط: محلول الوقاء الفوسفاتي 0.05 M pH=6.8، حجم الوسط: 900 مل، سرعة الدوران: 50 دورة/دقيقة. درجة الحرارة: °37 ± °0.5م، الزمن: 30 دقيقة، ويتبعها قياس الإمتصاصية UV عند طول الموجة 224 نانومتر.

القوة المميِّزة لتغيرات الثبات: يعتبر إيضاح القوة المميِّزة Discriminative Power أمراً أساسياً بالنسبة لطرائق الذوبانية بشكل خاص، وتتناول اعتبارات الثبات في تطوير طريقة الذوبانية ثبات المادة الدوائية في وسط الذوبانية وتغيرات الثبات في الشكل الجرعي عبر زمن صلاحيته كلاهما معاً، وإن توجيهات الثبات حسب الـ ICH قد خططت الظروف الخاصة باختبار الثبات التي يجب أن تتضمن اختبار الذوبانية في فترات زمنية فاصلة محددة. يجب أن تبقى طريقة الذوبانية دالّة على الثبات خلال زمن صلاحية المنتج، وقادرة على كشف التغيرات في سلوك الذوبانية الناتجة عن التدرك الفيزيائي أو الكيميائي للشكل الجرعي [13]. في اختبار الثبات، يطبق معامل التشابه Similarity factor (f₂) ومعامل الإختلاف Difference factor (f₁) لمقارنة مخططات الذوبانية لصيغة دوائية تم تخزينها تحت ظروف مختلفة (مثال: دراسات الثبات المسرع أو في الظروف الحقيقية)، فإذا تغير مخطط ذوبانية المادة الدوائية بشكل مهم عبر الزمن أو تحت ظروف الإجهاد، يمكن أن يشير ذلك إلى مشاكل ثبات، تساعد معاملات التشابه على تقدير مدى هذه التغيرات بشكل كمي [14]. تم الإستفادة من هذه المعلومات المرجعية في تقييم قوة طريقة الذوبانية المميزة لثبات المنتج الصلب من خلال دراسة مدى التشابه بين مخططات الذوبانية للعينات قبل وبعد التدرك. يتم استعمال معامل الإختلاف Difference factor (f₁) ومعامل التشابه Similarity factor (f₂) لمقارنة مخططات الذوبانية. يحسُب معامل الإختلاف (f₁) الإختلاف المئوي (%) بين مخططين عند كل نقطة زمنية وهو مقياس للخطأ النسبي بين المخططين، ويتم حسابه بتطبيق العلاقة (3):

إن معامل التشابه (f₂) هو مقياس للتشابه في الذوبانية المئوية (%) بين المخططين، ويتم حسابه بتطبيق العلاقة (4):

حيث: n هو عدد النقاط الزمنية، R_t هي قيمة الذوبانية للوجبة القياسية (قبل التغير) عند الزمن t،  T_t هي قيمة الذوبانية للوجبة قيد الإختبار (بعد التغير) عند الزمن t. لِكَي تعتبر مخططات الذوبانية متشابهة، يجب أن يكون معامل الإختلاف f₁ قريباً من الصفر ومعامل التشابه f₂ قريباً من 100. بشكل عام، إذا كانت قيم معامل الإختلاف f₁ أقل من 15 أي تقع في المجال (0-15) وإذا كانت قيم معامل التشابه f₂ أكبر من 50 أي تقع في المجال (50-100) فهذا يؤكد تماثل أو تكافؤ المخططين، وذلك حسب الإرشادات الصادرة عن الـ FDA المتعلقة باختبار الإنحلالية للأشكال الجرعية الفموية الصلبة مباشرة التحرر[15] . وبالتالي تعتبر طريقة الذوبانية مميزة لتغيرات الثبات إذا لم يتحقق التشابه بين مخططات الذوبانية للمنتج قبل التدرك والمنتج بعد التدرك. لدى حساب قيم معاملات التشابه والإختلاف بين مخططات المنتج قبل التدرك والمنتج بعد التدرك المبينة في الشكل (4)، كانت قيمة معامل التشابه f₂ مساوية39.09  وكانت قيمة معامل الإختلاف f₁ مساوية 28.78 أي أن معامل التشابه f₂ أقل من 50 ومعامل الإختلاف f₁ أكبر من 15، وبالتالي فإن مخططات المنتج قبل التدرك والمنتج بعد التدرك غير متشابهة وطريقة الذوبانية مميزة لتغيرات الثبات.

القوة المميِّزة لتغيرات الصيغة والتصنيع: يجب أن تكشف طريقة الذوبانية عن تغيرات ذات معنى في المعايير الحرجة للتصنيع والخواص الحرجة للصيغة. نظراً لأن المادة الدوائية المدروسة (إمباغليفلوزين) تنتمي إلى التصنيف الحيوي الصيدلاني BCS class III (عالية الذوبان الفيزيولوجي وقليلة النفاذية المعوية)، فإن حجم الجزيئات لا يعتبر عاملاً حرجاً بالنسبة لذوبانية المستحضر الذي يحتوي على الإمباغليفلوزين.. لذلك، لا يمكننا استخدام حجم الجزيئات كعامل حرج يساهم في تقييم قوة طريقة الذوبانية المميزة لتغيرات الصيغة كما هو معتاد، لذلك بدأ البحث عن متغير حرج آخر للصيغة لتقييم هذه القوة المميزة، ونظراً لأن هذه الدراسة تتناول منتجات المبعثرات الصلبة، وباعتبار أن المادة الحاملة هي عنصر أساسي في صيغة المبعثر الصلب، تم اعتماد نسبة التحميل (نسبة مادة دوائية إلى مادة حاملة) كمعيار أساسي في دراسة قوة طريقة الذوبانية المميزة لتغيرات الصيغة، حيث يجب أن تكون طريقة الذوبانية لمنتجات المبعثرات الصلبة العديمة الشكل ذات قدرة مميزة، وإن أوساط الذوبانية الحاوية على HPC قادرة على كشف الزيادة في القسم البلوري في المنتج مع ظروف التقادم في العمر والتخزين كما ينعكس ذلك في النقصان في المادة الدوائية المئوية المنحلة [16]. تم اختيار الـ هيدروكسي بروبيل سيلولوز HPC كمادة حاملة، لأنها أحد السواغات الداخلة في تركيب المشابه العالمي (جارديانس Jardiance) [7]. يمكن أن يستعمل الـ هيدروكسي بروبيل سيلولوز كعامل مؤلف للقالب مديد التحرر، وتزداد سرعة تحرر المادة الدوائية مع تناقص لزوجة الهيدروكسي بروبيل سيلولوز، وإن زيادة تركيز هذه المادة تسبب زيادة لزوجة المحاليل المحتوية عليها[17] . تم أيضاً الإستفادة من هذه المعلومات المرجعية الخاصة بالهيدروكسي بروبيل سيلولوز في استخدام نسبة التحميل (نسبة مادة دوائية/مادة حاملة) كأحد متغيرات الصيغة المستخدمة في تقييم قوة طريقة الذوبانية المميزة لتغيرات الصيغة من خلال دراسة مدى التشابه بين مخططات الذوبانية للعينات المحضرة بنسب تحميل مختلفة، حيث تم تحدي طريقة الذوبانية المطوَّرة بتطبيقها على منتجات مختلفة للإمباغليفلوزين ومحضرة باستعمال نسب تحميل مختلفة من المادة الدوائية أي نسب مختلفة من مادة دوائية/مادة حاملة. لدى حساب قيم معاملات التشابه والإختلاف بين مخططات المنتج المحضر باستعمال نسب تحميل مختلفة والمبينة في الشكل (5)، كانت جميع قيم معاملات التشابه f₂ بين المخطط والمخطط الأقرب له أقل من 50 وكانت قيم معاملات الإختلاف f₁ لهذه المخططات أكبر من 15 مما يعني أن مخططات المنتج المحضر باستعمال نسب تحميل مختلفة غير متشابهة، وبالتالي فإن طريقة الذوبانية المطورة قد حققت اختلافاً واضحاً في مخططات الذوبانية اعتماداً على التغير في نسبة التحميل، أي أن هذه الطريقة حساسة لتغيرات الصيغة، كما أن هذه الطريقة قادرة على كشف تغيرات الذوبانية في المنتج الدوائي التي يسببها التغيير في الصيغة، أي أن الطريقة المطورة مميزة لتغيرات الصيغة. بناء على كل ما سبق، فإن الشروط المثلى المعتَمَدة لطريقة الذوبانية المطوَّرَة هي: الجهاز المستعمل:USP apparatus 2 ، الطريقة: طريقة المجداف Paddle Method. الوسط: محلول الوقاء الفوسفاتي0.05 M ، pH=6.8، حجم الوسط: 900 مل، سرعة الدوران: 50 دورة/دقيقة، درجة الحرارة: °37 ± °0.5م، زمن أخذ العينات: بعد: 5 دقائق، 10 دقائق، 15 دقيقة، 20 دقيقة، 30 دقيقة، طريقة المقايسة: طريقة الإمتصاصية للأشعة فوق البنفسجية UV، عند طول الموجة 224 نانومتر.

تطوير طريقة المقايسة المؤشرة للثبات: بدأت عملية تطوير طريقة المقايسة بدراسة الخواص الفيزيوكيميائية للمادة الدوائية المدروسة، ودراسة ذوبانها في المحلات العضوية المختلفة، ونظراً لأنه قد تبين أن الإمباغليفلوزين مادة منحلة في مزيج أسيتونتريل/ماء 50%، تم تحضير الطور المتحرك المبدئي المؤلف من مزيج متساوي الحجوم من محلول الوقاء المائي والأسيتونتريل، وقد تم استعمال الأسيتونتريل بدلاً من الميتانول لأن المراجع المتعلقة بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء HPLC تنصح بالبدء بمزيج متساوي الحجوم من الطور المائي والأسيتونتريل كطور متحرك بالإضافة إلى أنه قد تبين أيضاً أن الإمباغليفلوزين مادة منحلة بصعوبة في الميتانول كما أن الطور المتحرك الذي يحتوي على الميتانول ذو خط أساس غير ثابت. بناء عليه، تم تحضير الطور المتحرك الأول بمزج الطور المائي (محلول الوقاء الفوسفاتي0.05M ) مع الطور العضوي (أسيتونتريل) بالنسبة الحجمية(50:50) . لدى تسجيل طيف الإمتصاص للأشعة فوق البنفسجية UV لعينة الإمباغليفلوزين، لوحظ أنها تبدي امتصاصاً أعظمياً عند طول الموجة 224 نانومتر وبالتالي تم اختيار طول الموجة هذا ليكون طول موجة الكشف من أجل التحليل الكروماتوغرافي لهذه المادة ضمن شكلها الصلب حيث تم تسجيل جميع المخططات الكروماتوغرافية عند طول موجة الكشف المعتمدة للإمباغليفلوزين ( 224نانومتر)، ثم تم إجراء عدة تجارب باستعمال تراكيب مختلفة للطور المتحرك وتم تقييم معايير الفصل واختبارات القمة وزمن الإحتباس لقمة الإمباغليفلوزين من أجل كل طور، حيث تم تقييم التباين بين القمة والقمة الأقرب لها Peak Resolution وتذيل القمة Peak Tailing وإشابة القمةPeak Impurity ، وتمت معالجة أي خلل في الفصل أو اختبارات القمة للطور المتحرك بإجراء تغييرات لتحسين الفصل حيث تم إجراء التغييرات في: pH الطور المتحرك، النسبة المئوية الحجمية للمحل العضوي (الأسيتونتريل أو الميتانول(، نوع المحل العضوي) أسيتونتريل أو ميتانول أو الأسيتونتريل والميتانول)، نوع العمود، درجة حرارة العمود، وتم الإنتقال من طور إلى آخر أفضل وهكذا حتى الوصول للطور المتحرك الأمثل. يبين الجدول (4) الأطوار المتحركة والشروط المستعملة تِباعاً في مرحلة التطوير من أجل التوصل إلى الشروط الكروماتوغرافية المثلى لطريقة المقايسة، حيث كانت الشروط الكروماتوغرافية المثلى للطريقة التحليلية المطورة: الجهاز: جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور المعكوس(Shimadzu LC-20AT) RP-HPLC ، المجهز بكاشف الـ PDA، طول موجة الكشف:  224  نانومتر، نظام الفصل: الفصل الإيزوكراتي Isocratic elution، الطور المتحرك: مزيج مرشح ومنزوع الغازات مؤلف من الميتانول والأسيتونتريل ومحلول الوقاء الفوسفاتي pH=3.0 (50mM)، بنسبة 30:10:60) حجم/حجم/حجم(، معدل تدفق الطور المُتَحَرِّك: 1 مل/دقيقة، العمود: (250 ملم × 4.6 ملم) يحتوي على طور معكوسC18  بأبعاد جزيئات 5 ميكرومتر، درجة حرارة العمود: 30◦م، حجم الحقنة: 20 ميكروليتر، زمن التحليل: 10 دقائق. حققت الشروط الكروماتوغرافية المثلى للطريقة المطورة قمة نقية ومتناظرة للإمباغليفلوزين بزمن احتباس يساوي 6.3 دقيقة، بمعايير أفضل للقمة فقد تحققت قمة أقل تذيلاً وأكثر تمايزاً حيث كان الميز لهذه  القمة أكبر من  2.0(قيمة الميز 10.09)، وكان عامل التذيل أقل من 2.0 (قيمة عامل التذيل 1.117)، كما تبين أنه باستعمال الطور المتحرك الأمثل تم الحصول على الفصل الأفضل والحساسية الأفضل. قد أعطى معدل التدفق 1 مل/دقيقة نسبة إشارة إلى ضجيج ممتازة مع زمن فصل معقول. يبين الشكل (6) المخطط الكروماتوغرافي النموذجي للإمباغليفلوزين الناتج عن تطبيق الشروط الكروماتوغرافية المثلى.

دراسات التحقق من مصدوقية الطرائق المطورة:

النوعية: تم التحقق من نوعية طريقة الذوبانية من أجل التأكد من أن سواغات الصيغة ووسط الذوبانية لا تتداخل مع تحليل الإمباغليفلوزين، ولا تؤثر على التحديد الكمي للإمباغليفلوزين المنحل. يبين الشكل (7) أطياف الإمتصاصية للأشعة فوق البنفسجية لكل من محلول المنتج وسواغات الصيغة، حيث تبين هذه الأطياف عدم وجود تداخل مهم بين امتصاص السواغات الصيدلانية وامتصاص الإمباغليفلوزين عند طول الموجة 224 نانومتر. وقد بلغت نسبة التداخل 0.78% فقط علماً بأن الحد المسموح للتداخل هو 2.0%، كما تم أيضاً إيضاح نوعية طريقة المقايسة المطورة (طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور المعكوس RP-HPLC) من خلال تسجيل المخططات الكروماتوغرافية الممثِلة للمنتج ولمزيج السواغات كما هو مبين في الشكل (8) ومقارنة المخطط الكروماتوغرافي الناتج عن المستحضر بالمخطط الكروماتوغرافي الناتج عن مزيج السواغات من أجل رصد أي تداخل بين قمة الإمباغليفلوزين المعنونة والسواغات، وتم حساب التباين (الميز) بين قمة الإمباغليفلوزين والقمم الأقرب إليها وكانت النتيجة أن معامل الميز تساوي 10.09 أي أنه لا يقل عن 2.0، ولا يوجد أي  تداخل بين قمة الإمباغليفلوزين والسواغات عند زمن احتباس قمة الإمباغليفلوزين، أي أنه قد تم تحقيق الفصل الكامل للمادة الدوائية بوجود سواغات الشكل الصلب، وبالتالي فإن طريقة المقايسة نوعيةSpecific . تم أيضاً إجراء اختبار نقاوة قمة الإمباغليفلوزين باستعمال كاشف الصمام الضوئي الثنائيPDA ، حيث تم تسجيل منحني النقاوة الكروماتوغرافية لقمة الإمباغليفلوزين وقيم قرينة نقاوة القمةPeak purity index  وعتبة النقطة المفردةSingle-point threshold ، وقد تبين أن هذه القمة نقية، (أعطى جهاز الـ HPLC النتيجة التالية: (Impurity: Not Detected وأنها لا تعود إلى أكثر من مكون واحد كما هو مبين في الشكل (9)، مما أعطى دليلاً إضافياً مفيداً في إظهار نوعية طريقة المقايسة المطورة. يساعد اختبار الإجهاد للمادة الدوائية في استعراف نواتج التدرك المحتملة التي تساعد بدورها في التعرف على طرائق التدرك وفي التحقق من القوة المميزة للثبات للطرائق التحليلية المطبقة [18]. بعد انتهاء دراسات التدرك بالإجهاد لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية، تم تحليل العينات المتدركة وغير المتدركة بواسطة طريقة الـRP-HPLC  المطورة، ويظهر الشكل (10) المخططات الكروماتوغرافية لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية بعد أن تعرضت إلى كل من الحرارة الجافة والضوء والأكسدة، وقد تبين أن طريقة المقايسة المطورة قادرة على تحقيق الفصل الكامل وعدم وجود تداخلات بين قمة الإمباغليفلوزين وقمم نواتج التدرك وبالتالي فإن طريقة المقايسة مؤشرة للثبات.

الخطية: بعد رسم منحنيات السلسلة المعيارية باستخدام 6 تراكيز للمحاليل المعيارية للإمباغليفلوزين وتسجيل قيم الإستجابات في طريقة الذوبانية (ذوبانية العينة) وطريقة المقايسة (مساحة القمة للعينة)، وكانت معاملات الإرتباط أكبر من 0.99، حيث تبين أن معامل الإرتباط بالنسبة لطريقة الذوبانية يساوي 0.9996 ومعامل الإرتباط بالنسبة لطريقة المقايسة يساوي 0.9999، ولدى تحليل التباين (Anova) عند معامل ثقة P = 0.05، قد تبين أن قيمة F المحسوبة اقل من قيمة F الحرجة بالنسبة للطريقتين مما يؤكد وجود ارتباط خطي بين التراكيز والإستجابات وأنه لا يوجد أي انحراف عن الخطية، وبالتالي فإن الطرائق التحليلية المطورة خطية. قد تبين أيضاً أن حد الكشف هو 0.32 مكغ/مل والحد الكمي 0.96 مكغ/مل بالنسبة لطريقة الذوبانية، وأن حد الكشف هو 0.30 مكغ/مل والحد الكمي 0.91 مكغ/مل بالنسبة لطريقة المقايسة.

المجال: تمت دراسة مجالات الطرائق المطورة للذوبانية والمقايسة بناءً على توجيهات الـ ICH [5]. بالنسبة لاختبار الذوبانية، يكون المجال الأدنى عادة +/- 20% زيادة عن المجال الموصوف. إن المجال المعتمد بالنسبة لطريقة الذوبانية المطوَّرة هو 1 – 30 مكغ/مل، حيث يشمل هذا المجال النسب المئوية القليلة المنحلة عند النقاط الزمنية البدئية من مخطط الذوبانية للمنتج بعد التدرك كما يتجاوز هذا المجال الجرعة العظمى التي يمكن ذوبانها للمنتج غير المتدرك. بالنسبة لاختبار المقايسة، يكون المجال الأدنى عادة ما لا يقل عن 80% إلى 120% من تركيز الإختبار. إن المجال المعتمد بالنسبة لطريقة المقايسة المطوَّرة هو 5 – 30 مكغ/مل، حيث يشمل هذا المجال النسب المئوية القليلة المحتواة عند النقاط الزمنية الأخيرة من مخطط الثبات للمنتج بعد التدرك وبنفس الوقت يتجاوز هذا المجال النسبة الأعظمية المسموحة من الكمية المصرحة من المادة الدوائية في المنتج الدوائي. إن هذه المجالات قد حققت درجة مقبولة من الخطية والمضبوطية والدقة للطرائق المطورة.

المضبوطية: بالنسبة لطريقة الذوبانية، تراوحت قيم النسبة المئوية للإستعادة في العينات التي تمت عليها الإضافة بين 99.81 و104.13% مع متوسط كلّي للنسبة المئوية للإستعادة يساوي 101.64%، وتراوحت قيم النسبة المئوية للإستعادة في العينات التي تمت عليها الإضافة بالنسبة لطريقة المقايسة بين 98.11 و100.53% مع متوسط كلي للنسبة المئوية للإستعادة يساوي 99.41%. بالنسبة للطريقتين، كانت قيم متوسطات النسبة المئوية للإستعادة ضمن المجال المقبول الذي يتراوح بين 97.0% و103.0%، وكانت المتوسطات الكلية للنسبة المئوية للإستعادة ضمن المجال المقبول الذي يتراوح بين 98.0% و102.0%، أي أن قيم النسبة المئوية للإستعادة قد بينت وجود مستوى مقبول وجيد لمضبوطية هذه الطرائق التحليلية، وبالتالي فإن هذه الطرائق مضبوطة.

الدقة: أظهرت الطرائق المطوَّرة تكرارية جيدة للقياسات الستة مع انحراف معياري نسبي يساوي 1.35% بالنسبة لطريقة الذوبانية، ويساوي 0.15% بالنسبة لطريقة المقايسة، أي أن الإنحراف المعياري النسبي بالنسبة للطريقتين لم يتجاوز الحد المقبول وهو 2.0%، كما بينت دراسة الدقة الوسطية عدم وجود انحرافات نسبية كبيرة في الأيام المختلفة، حيث تم اتباع تصميم للتجارب من أجل قياس الدقة الوسطية وكانت جميع الإنحرافات أيضاً أقل من 2.0% بالنسبة للطريقتين، مما يؤكد أن الطرائق المطورة دقيقة من حيث التكرارية والدقة الوسطية.

المتانة: إن متانة الإجراء التحليلي هي مقياس لقدرة هذا الإجراء على التوافق مع حدود الأداء المتوقعة خلال الإستعمال الطبيعي، ويتم اختبار المتانة بإجراء تغيرات متَعَمّدة في معايير الإجراء التحليلي، وعادةً يتم تقييم المتانة كجزء من عملية التطوير قبل إجراء دراسة التحقق من مصدوقية الإجراء التحليلي، فإذا تم التقييم المسبَق للمتانة خلال عملية التطوير، فهي لا تحتاج أن تتم إعادتها خلال التحقق من المصدوقية حسب الـ ICH Q14 [19]. أثناء تطوير طريقة الذوبانية، قد تمت دراسة العديد من المعايير التحليلية مثل تركيب وسط الذوبانية وpH وسط الذوبانية وسرعة التحريك، وقد تمت أيضاً دراسة تأثير بعض المعايير التحليلية مثل تركيب الطور المتحرك وpH الطور المتحرك ومعدل التدفق أثناء تطوير طريقة المقايسة. بينت نتائج دراسة المتانة لكل من الطريقتين أن جميع قيم عامل الإستجابة النسبي تقع ضمن المجال 0.8-1.2، وبالتالي لا حاجة لتطبيق أي إجراء تصحيحي بالنسبة للطريقتين، حيث بينت دراسة متانة طريقة الذوبانية أن قيم متوسط النسبة المئوية للإستعادة بعد تغيير بعض المعايير التحليلية هي 99.63 و99.12 و100.75%، أي أن متوسط النسبة المئوية للإستعادة كان قريباً من 100%، وقد ترافقت هذه القيم مع قيم دنيا للإنحراف المعياري النسبي، وكان لتغيير بعض المعايير التحليلية أيضاً تأثيرات مهملة على نتائج استرداد طريقة المقايسة حيث كان متوسط النسبة المئوية للإستعادة مساوياً 100.50 و99.36 و99.78%، ولم يتجاوز الإنحراف المعياري النسبي القيمة 0.2% كما هو مبين في الجدول (5).

 

الإستنتاجات Conclusions

تم تطوير طريقة ذوبانية مميزة للتحرر ولتغيرات الثبات وتغيرات الصيغة والتصنيع وطريقة مقايسة مؤشرة للثبات للشكل الصلب لمادة الإمباغليفلوزين الدوائية قليلة الذوبان في الماء، حيث تبين أن طريقة الذوبانية المطورة مناسبة من أجل تحليل الذوبانية والثبات الفيزيائي للإمباغليفلوزين في الأشكال الصيدلانية الصلبة، كما تبين أيضاً أن طريقة المقايسة المطورة (طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور المعكوس RP-HPLC) مناسبة من أجل تحليل المقايسة والثبات الكيميائي للإمباغليفلوزين في هذه الأشكال الصلبة، وكانت نتائج دراسة معايير التحقق من مصدوقية الطرائق التحليلية المطورة مقبولة، حيث بينت دراسة التحقق من المصدوقية أن هذه الطرائق مؤشرة للثبات، نوعية، خطية، صحيحة، دقيقة، وبالتالي يمكن استخدام هذه الطرائق في المراقبة الدوائية الروتينية وفي دراسات الثبات للشكل الصيدلاني الصلب للإمباغليفلوزين. يمكن الإستنتاج أيضاً أن الإختبارات الفيزييوكيميائية للمادة الدوائية (اختبارات الذوبان والثبات والإمتصاصية) تلعب دوراً هاماً وأساسياً في تطوير الطرائق التحليلية، وأنه يمكننا رفع القدرة المميزة للثبات للطرائق المطورة استناداً إلى نتائج هذه الإختبارات. قد تبين أنه يمكننا أيضاً تحقيق مقاربة مناسبة علمية عن طريق تطبيق مبادئ (الجودة من خلال التصميم (QbD)) على الطرائق التحليلية لِما تتمتع به هذه المقاربة من ميزات وأهمها النوعية والمتانة، مما يساهم في رفع مستوى أداء الطرائق التحليلية للمواد الدوائية قليلة الذوبان ضمن منتجاتها الدوائية الصلبة.

 

قائمة الإختصارات List of abbreviations

المقابِل باللغة العربية	الإختصار	المقابِل باللغة الإنكليزية
نظام التصنيف الحيوي الصيدلاني	BCS	Biopharmaceutical Classification System
إدارة الغذاء والدواء	FDA	Food and Drug Administration
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء	HPLC	High-performance Liquid Chromatography
المؤتمر الدولي للمواءمة	ICH	International Conference on Harmonization
حد الكشف	LOD	Limit of Detection
حد القياس الكمي	LOQ	Limit of Quantitation
المصفوفة الثنائية	PDA	Photodiode Array
الجودة من خلال التصميم	QbD	Quality by Design
الكمية	Q	Quantity
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء             ذات الطور المعكوس	RP-HPLC	Reversed-phase High Performance    Liquid Chromatography
فوق البنفسجي	UV	Ultraviolet
دستور الأدوية الأميركي	USP	United States Pharmacopoeia

 

الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركةEthics approval and consent to participate

غير قابل للتطبيق.

 

تضارب المصالحConflict of interests

يقر المؤلفون بعدم وجود مصالح متضاربة.

 

التمويلFunding

تم تمويل هذا البحث من قبل جامعة دمشق حيث قامت الجهة المموّلة (جامعة دمشق) بالتزويد بالمواد والأدوات والأجهزة المطلوبة.

 

مساهمات المؤلفينAuthors’ contributions

ساهم المؤلف (أ.م.د. إياد حمد اللوص) في الإشراف على الجانب المتعلق بطرائق التدرك الكيميائي للإمباغليفلوزين وتقييم قدرة طريقة الـ HPLC على فصل نواتج التدرك العضوية، وساهم المؤلف (أ.م.د. يوسف صطوف الأحمد) في الإشراف على الجانب المتعلق بتقييم تطوير الطرائق المطورة للشكل الصلب للإمباغليفلوزين والتحقق من مصدوقيتها، كما ساهم المؤلف (أ.م.د. شعيب عيسى الأحمد) في الإشراف على الجانب التحليلي الصيدلاني المتعلق بالبحث وتقييم مدى مطابقة تصميم الدراسة للقواعد الحديثة الصادرة عن الـ FDA والـ ICH. قام الأساتذة المؤلفون (أ.م.د. إياد حمد اللوص، أ.م.د. يوسف صطوف الأحمد، أ.م.د. شعيب عيسى الأحمد) بتدقيق المقال وتقديم الإرشادات اللازمة لضمان جودة المقال والعمل البحثي، وساهمت المؤلفة (ص. ميرفت عبدو مراد) في جميع الأنشطة المتعلقة بالبحث من إجراء الدّراسة وجمع وتحليل البيانات وكتابة المقال.

 

الشكر والتقدير Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قِبل الكادر التعليمي والإداري في مخابر كلية الصيدلة بجامعة دمشق ومن قِبل كلية الصيدلة بجامعة حلب والكادر الفني في معامل الأدوية المحلية، وإن الباحثون يقرّون ذلك بامتنان من إسهامات الجهات الداعمة للبحث.

المراجع :

1- ICH Harmonised Tripartite Guideline. Pharmaceutical development Q8(R2), Geneva: International Conference for Harmonisation of Technical Requirements for Registration for Pharmaceuticals for Human Use; Aug 2009. Available from: https://database.ich.org/sites/default/files/Q8%28R2%29%20Guideline.pdf
2- Maguire J, Peng D, Office of Process and Facility (OPF), OPQ/CDER/FDA. How to Identify Critical Quality Attributes and Critical Process Parameters, North Bethesda, Maryland: FDA/PQRI 2nd Conference; October 2015 https://pqri.org/wp-content/uploads/2015/10/01-How-to-identify-CQA-CPP-CMA-Final.pdf
3- Food and Drug Administration (FDA). Quality by Design for ANDAs: An Example for Immediate-Release Dosage Forms, Maryland: Pharma Excipients; Apr 2012. Available from: https://www.pharmaexcipients.com/wp-content/uploads/2023/03/Quality-by-Design-for-ANDAs.pdf
4- Manglik R. Modern Pharmaceutical Analytical techniques. India: EduGorilla Publication; 2024.
5- ICH Harmonised Guideline. Validation of Analytical Procedures Q2(R2). Geneva: International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use; Nov 2023. Available from: https://database.ich.org/sites/default/files/ICH_Q2(R2)_Guideline_2023_1130.pdf [Accessed 20 Sep 2025].
6- Parikh. D. M. Handbook of Pharmaceutical Granulation Technology. 3rd ed. CRC press; 2010.
7- Food and Drug Administration (FDA): Jardiance 10 mg and 25 mg film-coated tablets (empagliflozin) Prescribing Information; Maryland: Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Sep 2023. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2023/204629s040lbl.pdf [Accessed 01 Dec 2023].
8- Syrian Ministry of Health: National Drugs List Of Syrian Arab Republic. 10th ed. Damascus: Syrian MOH; 2019.
9- Council Of Europe. British Pharmacopoeia 2019. 2019th ed. London: The Stationery Office on behalf of the Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA); 2021.
10- USP Convention. United States Pharmacopeia-National Formulary (USP 44-NF 39). 46th ed. Rockville: The United States Pharmacopeial Convention; 2021.
11- Food and Drug Administration (FDA). Guidance for Industry: Dissolution Testing and Acceptance Criteria for Immediate-Release Solid Oral Dosage Form Drug Products Containing High Solubility Drug Substances, Rockville, Aug 2018. Available from: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Dissolution-Testing-and-Acceptance-Criteria-for-Immediate-Release-Solid-Oral-Dosage-Form-Drug-Products-Containing-High-Solubility-Drug-Substances-Guidance-for-Industry.pdf
12- Food and Drug Administration (FDA). M9 Biopharmaceutics Classification System-Based Biowaivers Guidance for Industry, MD: FDA; May 2021. Available from: https://www.fda.gov/media/148472/download
13- M S., ‎ Seelam S.C., ‎ Nagabathula R. Analytical Methods for Drug Development. 1st ed. ThinkPlus Pharma Publications; 2025.
14- Text Book of Modern Pharmaceutics. Shashwat Publication: Notion Press Media Pvt. Limited; 2024.
15- Food and Drug Administration (FDA), Guidance for Industry: Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms, Rockville, MD, Center for Drug Evaluation and Research (CDER); Aug 1997. Available from: https://www.fda.gov/media/70936/download
16- Malick A.W., Choi D.S., Sandhu H., Chokshi H., Shah N. Amorphous Solid Dispersions: Theory and Practice. Springer; 2014.
17- Rowe R C., Sheskey P J., Cook W G., Quinn M E. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 7th ed. RPS Publishing: Pharmaceutical Press; 2012.
18- ICH Harmonised Guideline. Stability Testing of New Drug Substances and Products Q1A(R2), Geneva: International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; Feb 2003. https://database.ich.org/sites/default/files/Q1A%28R2%29%20Guideline.pdf
19- ICH Harmonised Guideline. Analytical Procedure Development Q14, Geneva: International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use; Nov 2023. Available from: https://database.ich.org/sites/default/files/ICH_Q14_Guideline_2023_1116_1.pdf [Accessed 23 Aug 2025].